基于GC-IMS技術分析石榴果酒釀制過程中揮發性風味成分的變化

張卜升,高杏,閆昕,崔丹瑤,呂曉彤,林良才,張翠英*

1(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學),天津,300457)2(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

石榴(PunicagranatumL.)為喬木或灌木,是石榴科石榴屬的多年生雙子葉落葉果樹,其原產于巴爾干半島及其鄰近區域,在我國已有2000余年的栽培歷史[1]。石榴也是一種傳統中藥材,《圖經本草》中記載：“榴葉者,治咽喉燥渴,止下痢漏精,消食祛火”。對于治療潰瘍、腹瀉以及口舌生瘡等具有一定的效果,同時也可以用作補血藥和抗寄生蟲藥[2]。此外,適當食用石榴還能促進女性身體健康,有效降低人體內長期累積的氧化膽固醇,并減緩機體的衰老[3-4]。因此,石榴作為一種功能性水果越來越受到消費者青睞[5]。

石榴果酒是以石榴果汁為原料,通過果酒酵母發酵而成的一種果酒[6]。隨著石榴酒產量的提高,有關石榴果酒的研究也受到廣泛關注。也有人研究了石榴酒的抗氧化功能成分,檢測出其中安石榴苷的含量達到(21.20±1.38)mg/100 mL,還含有沒食子酸、鞣花酸和香草酸等多酚類抗氧化物質,表現出高抗氧化能力[7]。果酒中風味物質的種類及含量的多少是影響其品質的關鍵,對于食品中的風味物質檢測一般采用電子鼻法、氣相-質譜聯用法[8],氣相-質譜聯用法需要對樣品進行前處理,比較麻煩且容易失真;電子鼻法雖不需要前處理,但對風味成分不能精準定性和定量。離子遷移圖譜(ion mobility spectrometry,IMS)在20世紀70年代便已經出現,以等離子色譜形式被應用[9],最早被使用在毒品、環境污染物的檢測、爆炸物的分析處理等方面[10],與GC技術聯用便出現了氣相-離子遷移譜技術(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS),相比于GC-MS技術,GC-IMS具有更加高效的分離能力以及靈敏的響應速度,無需進行樣品預處理,能夠廣泛地應用于不同樣品揮發性成分差異的分析[11],且GC-IMS技術能有效區分同分異構體[12]。目前對石榴酒釀造過程中風味成分變化的研究主要集中在發酵的前8 d[7,13-14],缺少釀制前后揮發性風味成分變化的報道。

本文采用GC-IMS對石榴果酒釀制前后揮發性風味成分遷移變化規律進行研究,旨在為石榴果酒釀造工藝的改進提供科學依據。

1 材料及方法

1.1 儀器與設備

FlavourSpec?風味分析儀,德國G.A.S公司;SPL-250恒溫培養箱,天津萊博瑞特儀器設備有限公司;-80 ℃超低溫冰箱,美國Thermo scientific公司。

1.2 材料與試劑

優質大青皮石榴,山東省棗莊市嶧城區所產;酵母菌采用安琪葡萄酒用高活性干酵母;蔗糖,市售。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒樣制備

工藝流程：

石榴→篩選→清洗→去皮→榨汁→調整糖度→添加活化后的酵母菌培養液(安琪果酒用高活性干酵母)→發酵→澄清→過濾→成品。

操作要點：石榴成熟季節,挑選充分成熟無病蟲害的完整果實,清洗后剝皮取籽,螺旋壓榨機壓榨,得石榴果汁,取其中100 mL果汁裝于塑料瓶中密封并標記為樣品1,于-80 ℃冰箱中保存;將剩余石榴汁的糖度調配至20°Brix,放置在5 L發酵罐中,在28 ℃下進行發酵,于20 d時取100 mL酒液裝于塑料瓶中標記為樣品2,同樣于-80 ℃冰箱中保存;剩余酒樣分離酒腳后于20～25 ℃避光陳釀,1年后取樣100 mL,標記為樣品3,樣品1、2、3均設置3組平行實驗,并標記為1-1,1-2,1-3;2-1,2-2,2-3;3-1,3-2,3-3,3組樣品用于檢測分析。

1.3.2 GC-IMS測定揮發性成分

樣品的預處理方法：將1 mL石榴酒樣置于20 mL頂空檢測瓶中,以500 r/min的轉速,在60 ℃的條件下孵育10 min后開始進樣。

GC-IMS分析條件：分析用色譜柱型號MXT-WAX(30 m×0.53 mm,1 μm),IMS溫度45 ℃,色譜柱溫度60 ℃,進樣針溫度85 ℃,載氣/漂移氣N2,分析時間30 min,自動進樣體積500 μL。

氣相色譜條件：0～2 min：漂移氣150 mL/min,載氣2 mL/min;2～10 min：漂移氣150 mL/min,載氣2 mL/min提升到10 mL/min;10～20 min：漂移氣150 mL/min,載氣10 mL/min提升到100 mL/min;20～30 min:漂移氣150 mL/min,載氣100 mL/min。

1.3.3 數據處理

使用GC-IMS儀器配套的VOCal軟件查看數據的定性和分析譜圖,使用到軟件內置的IMS數據庫和NIST數據庫進行物質的定性分析;Reporter插件用于二維和三維譜圖的差異對比;Gallery Plot插件用于比較不同樣品間揮發性有機物含量的差異;Dynamic PCA插件則用于主成分分析(picipal components analysis,PCA)及其圖表的繪制。

2 結果分析

2.1 石榴果汁果酒揮發性成分定性分析

結合圖1與表1可以看出,通過GC-IMS技術在石榴果汁和果酒樣品中共檢出并定性了36種揮發性成分,保留指數均在1 600以下,結合difference圖進行對比分析,酯類和醇類物質占大部分,包括12種酯類物質,6種醇類物質,此外還有醛類物質4種,酮類物質2種,酸類物質1種,烷類物質1種,醚類物質1種。檢出的36種成分中9對成分為其單體與二聚體或聚合物。出現此現象是由于在檢測過程中,一部分揮發性組分在經過漂移管之前會因為質子化中性組分的電離而出現二聚體或聚合物[15]。在GC-IMS測得的27種物質中,有18種(67%)為醇和酯,這表明大量的醇和酯是構成石榴酒香氣的主要成分。有學者采用HS-SPME-GC-MS技術測定石榴酒中易揮發物質,檢測出了酯類物質23種,醇類物質16種[16],與本研究得到的結果類似。

a-未發酵石榴汁;b-發酵20 d石榴酒;c-陳釀1年石榴酒圖1 不同階段樣品GC-IMS 分析譜圖Fig.1 GC-IMS analysis spectra of samples at different stages

表1 揮發性物質定性結果Table 1 Qualitative results of volatile substances

2.2 發酵前后樣品中的揮發性風味物質差異

圖2為利用Reporter插件制作的不同發酵階段石榴果汁果酒樣品中揮發性風味物質差異三維譜圖(保留時間,遷移時間和峰強度),從圖中可以直觀看出不同樣品揮發性有機物差異。為了方便觀察對比,圖3為二維俯視圖,其背景呈藍色,橫坐標1.0處紅色豎線為RIP峰(反應離子峰,經歸一化處理),縱坐標代表氣相色譜的保留時間(s),橫坐標代表離子遷移時間(歸一化處理)。RIP峰的兩側有許多點,其中每一種揮發性有機物對應一個點。RIP峰兩側點的顏色深淺代表這一揮發性有機物的濃度,白色表示該物質的濃度較低,紅色表示該物質的濃度較高,峰顏色越深則表明該物質濃度越大。為了使發酵前后樣品間的差異更加明顯,可以使用差異對比模式進行觀察：選取未發酵石榴汁的譜圖作為參比,其他樣品的譜圖扣減參比。如果二者所含揮發性有機物濃度相似,則扣減后的背景為白色,若呈現紅色便代表該物質的濃度高于參比,藍色則代表該物質的濃度低于參比,得到樣品的氣相離子遷移譜圖Difference圖(圖4)。在樣品2和3的Difference圖中可以明顯觀察到較多紅色斑點,表明發酵后產生了大量的揮發性風味物質。

圖2 GC-IMS 三維譜圖Fig.2 Three-dimensional spectrum of GC-IMS

圖3 GC-IMS 二維譜圖Fig.3 Two-dimensional spectrum of GC-IMS

圖4 GC-IMS 差異譜圖Fig.4 GC-IMS difference spectrum

2.3 發酵前后樣品中揮發性成分指紋圖譜對比

為了明確對比不同樣品揮發性風味物質的變化程度與變化規律,采用了Dynamic PCA插件制作了指紋圖譜(圖5),使不同發酵階段石榴酒樣品之間的揮發性有機物差異更加便于觀察比較。

在該指紋圖譜中,每一列代表同一揮發性有機物在不同樣品中的信號峰,每一行代表一個樣品中選取的全部信號峰,從圖中可以看出每種樣品的完整揮發性有機物信息以及樣品之間揮發性有機物的差異,圖中數字代表遷移譜庫中未定性的物質用數字代替。為了方便觀察比較,將變化規律相似的物質排在一起比較,并將其分為A、B、C 3個區域。通過圖5的指紋圖譜可觀察出3種樣品的特征揮發性物質和在發酵過程中揮發性物質的變化規律。圖中A區域物質顯示1號樣品(石榴果汁)的特征揮發性物質,在發酵過程中濃度降低或消失,主要有庚醛、壬醛和己醛等,而乙醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇等的濃度在發酵之后都有提升。圖中B區域物質(乙酸丁酯、乙酸異丁酯、1-丙醇和乙酸異戊酯等)代表2號樣品(發酵20 d石榴酒)的特征揮發性物質,其濃度遠大于其他樣品,主要是酯類物質。圖中C區域物質(辛酸乙酯、乙酸、丁醇和乳酸乙酯等)代表3號樣品(陳釀1年石榴酒)的特征揮發性物質,其在3號樣品中的峰顏色明顯較深,表明這些物質的含量高于其他樣品。

在石榴酒中,庚醛、壬醛和己醛等醛類物質含量明顯降低或消失,與此同時石榴酒中各種醇類物質含量增加。在發酵過程中有機酸被微生物大量合成,有機酸又與酒中的醇類物質發生酯化反應,生成多種酯類物質[17]。乙酸乙酯在石榴汁與石榴酒中均能被檢測到,且具有明顯的花果香(蘋果香,菠蘿香),是各種水果與花香的主要來源[18],經過發酵及陳釀后其在石榴酒中的含量也維持在較高水平。乙酸異戊酯具有香蕉香、蘋果香、甜香等特征,是各種酒類中都存在的特征香氣物質,其在石榴酒中也有一定含量[19]。乙酸異丁酯具有生梨、覆盆子香[19],在石榴汁中含量相對較低,其含量在發酵20 d時有明顯增加,經過陳釀后含量減少約30%,其在發酵過程中增加又在陳釀過程中減少的特性與LI等[15]在白蘭地的年齡與白蘭地中揮發性物質的相關性研究中得到的結果相同,即隨著陳釀的進行一些酯類物質的含量會隨之減少,可能是由于酯交換以及乙酸異戊酯和乙酸異丁酯的易揮發特性所導致。丁酸乙酯、己酸乙酯等物質含量在陳釀后明顯增加。中國黃酒與西方葡萄酒也是在陳釀中豐富其風味物質,WANG等[20]則將黃酒中風味物質的變化情況與陳釀年份結合,用以區分黃酒年齡。通過對比其他果酒風味物質研究結論發現,石榴酒中所含有的大量香氣成分是在發酵過程中累積的[21]。

圖5 GC-IMS 指紋圖譜Fig.5 GC-IMS fingerprint

2.4 石榴果酒主成分分析和指紋圖譜相似度分析

為了更加直觀地分析發酵前后石榴酒樣品風味物質的差異,使用Dynamic PCA插件繪制樣品的主成分分析圖(圖6),PC1和PC2的貢獻解釋了總變異的97%,1號樣品在圖的右側,2號樣品在圖的左下方,3號樣品在圖的左上方,2號樣品與3號樣品在圖中距離更近,表明其揮發性物質種類有很高的相似性,并且2、3號樣品與1號樣品可以明顯地區分開來,證明其特征風味物質在發酵前后有明顯的區別。由PCA圖分析可知,石榴酒在發酵前后風味差異較大,其中發酵20 d的樣品與陳釀1年的樣品也有一定差別。

圖6 主成分分析結果Fig.6 Principal component analysis results

3 結論

本文采用GC-IMS技術,對比分析了3種不同發酵階段的石榴酒中揮發性風味物質的遷移變化情況。3個樣品共檢測出74種揮發性成分,并定性了其36種成分,其中9對成分(2-甲基-1-丙醇、己醛、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、丁醇)為其單體與二聚體或多聚體,構建了風味物質遷移指紋圖譜。對其分析可知,石榴果汁發酵后,庚醛、壬醛和己醛等醛類物質濃度降低或消失,乙酸乙酯、乙醇、3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丙醇等物質含量有明顯升高。石榴酒發酵20 d和陳釀1年的揮發性物質的種類基本一致,其中乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸丁酯等有所減少,但陳釀后丁酸乙酯、己酸乙酯等物質含量明顯增加。