真菌β-1,3-葡聚糖基轉移酶研究進展

付鑫,朱鴻安,崔鳳杰,2 *,昝新藝,孫文敬,2

1(江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇 鎮江,212013) 2(江西省德興市百勤異VC鈉有限公司,江西 德興,334299)

葡聚糖是一大類由α/β-1,3、1,4或1,6-糖苷鍵連接葡萄糖單體形成的大分子多聚體,作為植物和真菌細胞壁的重要結構組分之一,在維持細胞形狀和完整性、保護細胞免受內部膨脹壓力和外部環境的影響等方面發揮關鍵性作用[1]。常見的β-1,3-葡聚糖包括可得然膠、普魯蘭多糖、昆布多糖、酵母細胞壁葡聚糖和香菇多糖等。真菌葡聚糖的免疫調節活性受到分子質量、構型、支鏈及分支度等的顯著影響，特別是含有β-1,3-鏈接的主鏈、β-1,6-鏈接的側鏈的葡聚糖具有良好的水溶性、免疫增強、調節腸道菌群和降血糖等功能[2]。MORALES等[3]發現，香菇子實體中含有β-1,6-的葡聚糖G1、β-1,3/1,6-的葡聚糖G2和α-1,3-的葡聚糖G3，其中G1具有較高的抗氧化活性。

當前,葡聚糖的合成途徑還未被系統地研究和闡明,但基因組學、分子遺傳學等學科的發展,很大程度加快了對真菌葡聚糖合成途徑和結構重構機制的認知。有關真菌葡聚糖生物合成的研究主要集中在菌體結構相對簡單、遺傳操作效率相對較容易的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)等低等真菌中[4-5]。以釀酒酵母葡聚糖的合成為例,通常認為,胞外葡萄糖被攝入后經過糖磷酸轉移酶系統(phosphotransferase system,PTS)轉化為葡萄糖-6-磷酸;進而通過葡萄糖-6-磷酸變位酶將其異構為葡萄糖-1-磷酸;再由UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化合成為UDP-葡萄糖,經葡聚糖合成酶將其轉移到葡聚糖主鏈的非還原端合成β-葡聚糖。新合成的β-葡聚糖經特定糖基轉移酶和水解酶的共同作用進行重構、交聯,形成不同分子量和分支結構的β-葡聚糖,與殼聚糖等共同構成細胞壁[6]。目前已有GH16、GH17和GH72等家族的糖基水解酶或者糖基轉移酶被證明在細胞壁組分的交聯中發揮作用。其中,GH16 家族水解酶(β-葡聚糖酶)主要參與葡聚糖和幾丁質的交聯,GH17 家族水解酶(β-葡聚糖酶)在葡聚糖之間的交聯中起作用,GH76 家族的甘露聚糖酶在細胞壁的生物發生中起作用,而GH72家族的β-1,3-葡聚糖轉移酶則被認為通過形成多分支的β-1,3-葡聚糖，主要參與細胞壁的重構。這些細胞壁重構酶中,屬于GH72 家族的β-1,3-葡聚糖轉移酶為重塑細胞壁的結構做出了重要的貢獻。因此,本文就近年來GH72 家族的β-1,3-葡聚糖轉移酶領域的主要研究結果進行綜述和展望。

1 β-1,3-葡聚糖基轉移酶及其分類

糖基轉移酶是指將單糖共價連接到多種有機底物上的一大類酶,這些酶驅動復雜的寡糖的合成,在細胞的整個生命周期中起著關鍵作用。β-1,3-葡聚糖基轉移酶能夠以β-1,3-糖苷鍵連接的葡聚糖為轉糖苷的受體和供體,通過轉糖苷作用生成新的糖苷鍵[7]。

GH72家族 β-1,3-葡聚糖基轉移酶是指能夠以β-1,3-糖苷鍵連接的葡聚糖為轉糖苷的受體和供體的一類葡聚糖基轉移酶，其通過內部切割 β-1,3-葡聚糖，將新生成的還原端轉移到另一個 β-1,3-葡聚糖分子的非還原端，使受體和供體分子之間產生新的 β-1,3-鍵，延伸和分支 β-1,3-葡聚糖的糖鏈[7-8]。截止目前，來源于細菌、絲狀真菌及酵母的 157種蛋白被鑒定為β-1,3-葡聚糖基轉移酶家族成員，均屬于糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol, GPI)錨定的膜蛋白[9-10]。常見的β-1,3-葡聚糖基轉移酶主要為煙曲霉、釀酒酵母和白色念珠菌中的同源基因Gel、Gas和Phr編碼的蛋白。

GH72家族成員包括72+和72-兩個亞家族(圖1),均含有1個GH72結構域和1個連接區,GH72結構域包含2個對催化至關重要的保守谷氨酸殘基和3個保守的酪氨酸殘基。對其家族的蛋白質序列的多重比對發現,除了典型的催化結構域外,72+和72-亞家族的區別主要在于其C-端是否有無半胱氨酸的碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding module family 43,CBM43,在Pfam數據庫中又被注釋為X8結構域)[11]。GH72+亞家族同時擁有GH72結構域和CBM43域;GH72-亞家族缺少CBM43/X8,其在C-末端有1個低復雜性區域。盡管二者存在區別,但GH72+和 GH72-均表現出相同的體外轉糖苷酶的活性,這也提示CBM43域在 GH72+酶的催化過程中起到更微妙的作用。在一些GH72家族成員中,在 C -端 GPI 連接信號之前的 C-端區域中存在1個高度O-甘露糖基化且對活性是可有可無的富含絲氨酸/蘇氨酸的區域(Ser/Thr-box)。另外,GH72酶還共享1個由規則間隔的半胱氨酸殘基組成的保守模式,這些殘基形成分子內的二硫鍵。在GH72+亞家族中,存在2個二硫鍵簇：簇I由3個二硫鍵組成,涉及GH72結構域和連接區保守的半胱氨酸殘基,簇II由4個二硫鍵組成,連接位于CBM43/X8的半胱氨酸殘基。而在GH72-酶中缺少簇II,這表明GH72結構域和CBM43構成了一個完整的結構和功能單元[12]。只有GH72+蛋白(如Gas1p、Gas2p和AfGel4p)具有延長和分支活性,而GH72-酶(如Gas5p、AfGel1p和AfGel2p)具有延長而不具有分支活性,表明CBM43對于正確識別催化底物、定位催化位點和形成分支結構必不可少[13]。

圖1 GH72家族系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of GH72 family

2 真菌β-1,3-葡聚糖基轉移酶

2.1 煙曲霉β-1,3-葡聚糖基轉移酶Gel家族

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的細胞壁構成主要是由 β-1,3-葡聚糖聚合物作為骨架,β-1,6分支點的支鏈葡聚糖作為側支,共價結合甲殼素、半乳甘露聚糖等其他組分[14]。GH72家族 β-1,3-葡聚糖基轉移酶在葡聚糖內切割糖鏈,并將新產生的還原端轉移到另一個β-1,3-葡聚糖分子的非還原端,實現其β-1,3-葡聚糖鏈的延長[14]。煙曲霉含有編碼GH72家族蛋白的7個基因Gel1～Gel7;其中Gel1(AFUA_2G01170)、Gel2(AFUA_6G11390)、Gel6(AFUA_3G13200)屬于GH72-亞家族,Gel3 (AFUA_2G12850)、Gel4(AFUA_2G05340)、Gel5(AFUA_8G02130)、Gel7(AFUA_6G13200)屬于GH72+亞家族。Gel1、Gel2和Gel4等3個基因在一系列的生長條件下,在菌絲生長過程中組合型表達,分別對葡聚糖的合成、菌絲形態發生、細胞壁完整性和致病能力等有著不同程度的影響[15]。在煙曲霉細胞壁中分離得到 β-1,3-葡聚糖基轉移酶Gel1p,克隆和測序編碼該酶的Gel1基因,結果表明,純化重組的GEL1p 通過GPI以與酵母同源蛋白相似的方式附著在煙曲霉細胞膜[16]。Gel1p在體外催化β-1,3-葡聚糖基轉移酶的兩步反應：首先,切斷供體β-1,3-葡聚糖鏈的內部糖苷鍵,釋放還原部分;然后將新的還原端轉移到受體 β-1,3-葡聚糖鏈的非還原端,從而延長其長度。Gel2p與Gel1p類似，屬于GPI錨定蛋白，包含4個內含子、5個N-糖基化位點,也具有 β-1,3-葡聚糖基轉移酶活性。有研究表明,Gel1p與Gel2p都能夠補充釀酒酵母中 ΔGas1p的缺失,充分證實了Gel1p、Gel2p與Gas1p具有類似的催化功能。然而,Gel1的缺失不會導致表型的改變,而ΔGel2突變體和ΔGel1ΔGel2雙突變體則表現出生長緩慢、分生孢子發生異常和細胞壁組成變化的現象。

煙曲霉Gel4p含有碳水化合物結合域CBM43[17],具有延伸 β-1,3-葡聚糖和分支糖鏈的雙重功能[18]。敲除Gle4會導致β-1,3-葡聚糖分支的消失,進而影響菌株生長。Gel4p在所有生長時期表達量最多。通過構建插入了Gel4 ORF的含有潮霉素抗性標記的敲除盒用于轉化煙曲霉原生質體,但未能成功獲得突變體,提示Gel4是其生長過程中必不可少的基因[17]。

β-1,3-葡聚糖基轉移酶的正常活性表達需要N-糖基化。N-糖基化缺失顯著下調突變株的細胞壁中 β-葡聚糖含量。為驗證這一功能,在ΔCwh41突變體中缺失編碼 β-1,3葡聚糖基轉移酶基因Gel1或Gel2的基因,構建雙突變體ΔGel1ΔCwh41或ΔGel2ΔCwh41,其生長表型與單突變體 ΔCwh41 相似,表明 Gel1和 Gel2是主要受ΔCwh41 中N-糖基化加工缺陷影響的蛋白質。通過定點突變去除了突變體ΔGel1Gel1-NMΔGel2Gel2-NM中Gel1p或Gel2p上所有潛在的N-糖基化位點后,其表現出與單一突變體ΔGel1或ΔGel2相似的表型。因此,N-糖基化對于 Gel1p 或 Gel2p 發揮功能必不可少[19]。

煙曲霉Gel7p是一種帶有N-末端連接碳水化合物的錨定蛋白,主要通過GPI錨定結合到細胞膜和細胞壁上,不受N-糖基化的影響,這表明在N-糖鏈加工缺陷的突變體中,Gel7可能參與維持N-糖鏈加工缺陷突變體細胞壁的完整性,特別是在高溫條件下。在突變菌株 ΔCwh41或 ΔGel1ΔCwh41中進一步敲除Gel7,導致其異常分生,細胞壁 β-1,3-葡聚糖含量顯著減少,萌發延遲;與野生株相比,ΔGel7在37 ℃時 β-葡聚糖和甲殼素的含量分別下降了21.5%和11.1%,50 ℃時β-葡聚糖和甲殼素的含量分別下降了25.6%和26.2%[20]。同時Gel7是煙曲霉分生孢子發生所必需的,Gel7p與Gel1p和Gel2p的序列相似,包括催化區FF(A/S)GNEV(用于催化酸堿)和F(F/L)(S/A)EYGCN(用于親核殘基)的兩個保守的天冬氨酸殘基,表明Gel7p也具有 β-1,3-糖基轉移酶活性[21]。在菌絲萌發階段Gel2和Gel7的表達量顯著提高,在菌絲生長階段它們的表達則被抑制;Gel1則在菌絲生長階段被誘導表達,表明在菌絲生長發育過程中Gel1、Gel2和Gel7的表達均受到一定程度的調節,其在不同時期表現出不同的功能。據此可推測,Gel7是煙曲霉分生孢子發生所必需的,同時在ΔGel7中可明顯誘導出Gel1～Gel6,表明Gel家族之間存在著密切的聯系。

2.2 副球孢子菌Paracoccidioides β-1,3-葡聚糖基轉移酶Gel家族

副球孢子菌ParacoccidioidesGel家族Gel1p(XP_002794189)和Gel2p(XP_002793109)屬于GH72-亞家族,Gel4p(XP_002792932)屬于GH72+亞家族。Gel1p、Gel2p和Gel4p具有相同的保守序列,其N-端相連的信號肽序列以及C端相連的GPI錨定區域與GH72蛋白家族中存在的保守結構域相同。其中Gel3p還包含1個Cys-Box的結構域,該結構域包含6個保守的半胱氨酸殘基[12]。研究結果表明,Gel1p與細胞壁合成密切相關,Gel2p可能在細胞質中合成,與細胞壁形成相關。遺傳互補研究顯示,Gel2p能夠恢復ΔGas1突變體中Gas1p活性的缺失,提示其參與維持真菌細胞壁的完整性;而Gel1p則無類似的功能。然而,Gel1p可恢復ΔGas1突變體中的端粒沉默,表明Gel1p可能參與了擬南芥中的轉錄沉默。而Gel4p具有恢復釀酒酵母ΔGas1突變表型的能力,表明其在真菌的細胞壁生物合成和形態變化過程中起積極作用[22]。

2.3 酵母β-1,3-葡聚糖基轉移酶Gel家族

酵母細胞壁中含量最豐富的多糖為β-1,3-葡聚糖,主要由1個催化亞基FKS和至少1個調節亞基Rho-1組成的葡聚糖合成酶復合體(glucan synthase complex,GSC)催化合成[23]。在細胞膜外空間,GH72家族酶催化β-1,3-葡聚糖的線性伸長以及延長分支點形成糖鏈側支[24]。

釀酒酵母Gas多基因家族含有編碼GH72家族蛋白的5個基因Gas1～Gas5。Gas1p和Gas2p屬于GH72+亞科,而Gas3p、Gas4p和Gas5p屬于GH72-亞科。序列分析發現,釀酒酵母中5個同源Gas蛋白Gas1～Gas5蛋白共享一個分泌信號序列和一個名為NtD的N-末端結構域,但各蛋白具有不同的C-末端延伸。另外僅在Gas1p和Gas2p中存在類似于碳水化合物結合域CBM43的Cys-Box結構域,其對于Gas蛋白的功能和穩定性必不可少。鑒于在所有 Gas 蛋白和所有 GH72 家族成員中保守的兩個谷氨酸殘基已被證明對催化至關重要,推測NtD 為Gas家族的主要催化結構域[25]。

Gas1p是一種GIP錨定蛋白,主要定位于細胞膜上,在營養生長過程中表達,在細胞壁組裝中起關鍵作用。Gas1p的缺失導致細胞形態發生缺陷和細胞壁葡聚糖分支交聯比例的減少[26]。目前已經證明酵母蛋白Gas1p、Phr1p和Phr2p具有與煙曲霉Gel1p、Gel2p蛋白和白色念珠菌的ScGas1、CaPhr1和CaPhr2蛋白相同的催化殘基和體外活性,此外,AfGel1、AfGel2和CaPhr1可以恢復釀酒酵母Gas1缺失突變體的缺陷表型[19]。轉錄組分析表明,Gas1+Gas5基因對在營養生長過程中表達,在減數分裂和產孢過程中受到抑制,而Gas2+Gas4基因則相反,其在孢子形態發生過程中起著重要的作用[27]。在營養生長過程中,Gas1p和Gas5p是細胞壁形成所必需的,其中Gas1p起主要作用,而Gas5p只起輔助作用。Gas2p和Gas4p是形成孢子壁所必需的,其機制是使孢子內壁層和外壁層相互連接,二者的缺失會導致無法正常形成孢子[28]。Gas3p作為釀酒酵母中一種高度甘露糖化發育調劑蛋白,但未呈現相關活性,在營養生長和孢子形成期間弱表達[29-30]。

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)基因組中存在4個編碼 β-1,3-葡聚糖基轉移酶的基因Gas1+、Gas2+、Gas4+和Gas5+，包含保守轉移酶結構域[31]，同時還含有CBM43以及富含Ser或Cys的結構域，并在C-末端存在GPI部分結合位點的疏水區[25]。在營養生長過程中，只有Gas1+、Gas2+和Gas5+表達，且其隨細胞周期變化呈周期性變化，提示各基因在細胞營養生長周期的不同階段發揮不同的功能。例如，Gas1+和Gas5+的轉錄水平在有絲分裂期間最高，而Gas2+轉錄水平在分裂前期較高；而在營養生長期Gas4+的表達水平最低，但在孢子形成期間顯著增加[32]。此外，Gas1+在維持細胞的完整性和活力以及細胞形態發生等過程均起到重要作用；ΔGas1突變體在沒有滲透穩定劑的情況下無法存活并不能經歷細胞裂解。在敲除Gas1后，細胞裂解發生在活躍的生長區域(極點和隔區)，不裂解的細胞表現為形態發生缺陷，即兩極變寬或內側區域變寬，提示Gas1p是裂殖酵母營養生長所必需。相反，ΔGas2突變體和ΔGas5突變體，甚至雙ΔGas2ΔGas5突變體，在所有培養溫度均可正常生長，并未顯示出明顯的生長缺陷[19]

2.4 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) β-1,3-葡聚糖基轉移酶Gel家族

通過與酵母中編碼Gas蛋白的基因序列相似性比對,現已推測出M.oryzae中含有5種Gelp,分別是Gel1p(MGG_07331.7)、Gel2p(MGG_06722.7)、Gel3p(MGG_08370.7)、Gel4p(MGG_11861.7)和Gel5p(MGG_03208.7)。該Gel家族含有一個N-端信號肽,其后是一個催化的GH72結構域(GH72 Pfam：PF03198),一個連接C-端低復雜度區域,Ser/Thr為29%～40%和一個公認的GPI錨點[33]。而Gel3p和Gel4p還包含一個X8結構域(PF07983)。據此,Gel3和Gel4屬于GH72+亞家族,而Gel1、Gel2和Gel5屬于GH72-亞家族。

ΔGel1ΔGel3ΔGel4M.oryzae突變體的細胞壁呈顯著變化,其中β-1,3-葡聚糖的聚合度比野生型菌株更高,分支更少。該突變體在基因表達的整體模式、超分支表型和無孢子形成方面均表現出顯著的差異,缺失3個Gel編碼基因ΔGel1ΔGel3ΔGel4的突變體不能引起稻瘟病,并且表現出超支菌絲和無孢子發育表型,表明Gelp在真菌細胞壁的結構修飾中起著重要作用,下調β-1,3-葡聚糖基轉移酶的活性可顯著干擾細胞壁的結構完整性和靈活性。分析ΔGel3ΔGel4M.oryzae突變體的細胞壁多糖結構也顯著變化,其中β-1,3-連接的葡萄糖殘基比例增加,末端葡萄糖和在分支點(1,3,6-Glcp)的殘基比例較低。這些數據表明,Gel3p與Gel4p在β-1,3-葡聚糖鏈的延伸過程中發揮作用,并參與分支結構的形式。

2.5 白假絲酵母(Candida albicans) β-1,3-葡聚糖基轉移酶Gel(Phr/Pga)家族

在Candidaalbicans中,Phr家族含有編碼GH72家族蛋白的5個基因Phr1～Phr3、Pga4、Pga5。其中Phr1p、Phr2p和Pga5p是GH72+亞家族的成員,Phr3p和Pga4p是GH72-亞家族的成員。

進化分析結果表明，Phr1和Phr2是Gas1的同源基因，Phr3與Gas4同源，Phr1和Phr2缺失顯著影響C.albicans的細胞形態；Pga4和Pga5則分別與Gas5和Gas2同源。目前，Phr家族功能的研究主要集中在Phr1p、Phr2p和Pga4p。結果表明，培養基成分、溫度和細胞形態對Phr1的轉錄水平影響不顯著[34]；但在pH為7.5～8.0條件下，Phr1表達水平最高；而Phr2的表達水平變化趨勢與Phr1相反，其在pH 4.0時最高，隨著pH的增加而降低[35]。與Phr1和Phr2不同，其他家族成員的表達完全不受環境pH的影響。Phr3被認為是該家族中唯一包含內含子并編碼缺乏可識別的GPI附著位點的蛋白質的基因[36]。通常認為，Phr3p和Pga5p與孢子形成有關，因此，在C.albicans繁殖和生長過程中，Phr3和Pga5并未發揮出相應的功能；另外，研究顯示，缺失Prh3、Pga4或Pga5并未顯著影響C.albicans的生長、形態或毒力，而Phr1、Phr2和煙曲霉菌的Gel1、Gel2被證明與小鼠感染模型致病密切相關[37-38]

3 真菌β-1,3-葡聚糖基轉移酶的催化機制

為了探究 β-1,3-葡聚糖基轉移酶的延長與分支糖鏈的功能,在釀酒酵母中鑒定出GH72家族糖基轉移酶Gas1p和GH17家族糖基轉移酶Bgl2p分別參與 β-1,3-葡聚糖分支。之前的研究表明,在 β-1,3-葡聚糖上引入 β-1,6-鍵是由GH17家族Bgl/Bgt蛋白完成的,其可從 β-1,3-寡糖的還原端切割葡萄糖單元,將酶結合的低聚糖轉移到受體 β-1,3-寡糖或非還原端的C-6或內部葡萄糖單元的C-6上形成分支[39]。

以釀酒酵母為模型,通過建立定量測定β-1,3-葡聚糖上β-1,6-支鏈的方法,主要是通過放射性標記底物UDP-(14C)葡萄糖,對其中分支減少的缺失突變體進行篩選。結果發現,與野生型菌株相比,ΔBgl2突變體和ΔGas1突變體的分支分別減少了15%和70%[18]。野生型菌株呈橢圓形,芽痕集中在一極[24]。而ΔGas1突變體表現出輕微的生長缺陷,細胞形態發生改變,細胞呈球形,芽痕分散[40]。ΔGas1ΔBgl2雙突變體表現為沒有分支,表現為生長速度慢、細胞形狀圓、出芽方式隨機。而ΔGas1突變體和ΔGas1ΔBgl2雙突變體細胞壁中的β-1,6-葡聚糖含量分別比野生型菌株降低了90%和98%,在細胞壁上沒有β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖的分支,表明 β-1,6-葡聚糖的生物合成發生在細胞壁,β-1,3-葡聚糖的衍生物是β-1,6-葡聚糖生物合成所必需的[41]。ΔBgl2突變體沒有表現出 β-1,3-葡聚糖分支缺陷或明顯的生長問題,這表明存在額外的替代分支機制[42]。而研究表明,GH72家族中ScGas1p、ScGas2p和AfGel4p具有雙重的β-1,3-葡聚糖伸長和分支活性,其在其C-末端都含有CBM43,同樣屬于GH72家族但缺乏CBM43的ScGas5p、AfGel1p和AfGel2p只顯示了延伸β-1,3-葡聚糖的活性。

綜上所述,在釀酒酵母中,Gas1p和Bgl2p都參與了細胞壁的β-1,3-葡聚糖的 β-1,6-分支的形成,Gas1p負責主要的分支活性,但在Gas1p和Bgl2p同時存在的情況下表現出最佳的分支活性,這表明它們在 β-1,3-葡聚糖分支過程中具有協同作用(如圖2所示)。Bgl2p優先使用短鏈(≥5),而Gas1p的分支活性首先需要形成長葡聚糖(≥11)。β-1,3-葡聚糖線性伸長是前提條件,CBM43對伸長的 β-1,3-葡聚糖的定位是Gas蛋白后續分支活性所絕對需要的。

圖2 釀酒酵母細胞壁β-(1,3)-葡聚糖分支的可能機制[18]Fig.2 Predicted mechanism of S.cerevisiae cell wall β-(1,3)-glucan branching[18]

4 展望

近20年來的研究已顯著提高了對真菌葡聚糖結構和功能的認識。然而,有關葡聚糖糖鏈的延伸和分支化的形成仍認識不足。例如,GEL家族是否也具有切割β-(1→6)-葡聚糖糖鏈的功能？能否轉移β-(1→6)-糖鏈至β-(1→3)-葡聚糖糖鏈或轉移β-(1→3)-糖鏈至β-(1→6)-糖鏈,形成多分支的β-(1→3)/β-(1→6)-葡聚糖？這些過程還有待進一步系統研究和全面揭示。為此,今后還可以在以下幾個方面做進一步分析：(1)準確檢測β-1,3-葡聚糖轉移酶催化產物(中間產物)的結構性質是解析其切割和轉移糖鏈的規律和機制的基礎;(2)β-1,3-葡聚糖轉移酶的生化性質、晶體結構等尚需進一步準確解析;(3)不同來源的真菌β-1,3-葡聚糖轉移酶的催化形成β-(1→3)/β-(1→6)-分支化葡聚糖的機制的共性和區別還需系統對比;(4)可構建CRISPR-Cas9基因編輯系統靶向敲除真菌β-1,3-葡聚糖轉移酶,通過觀察菌絲形態和細胞壁微觀結構、葡聚糖分支化位點以及分支度等,明確其在葡聚糖合成和細胞壁形成過程中發揮的作用。這些研究將為真菌葡聚糖,特別是食藥用真菌多分支葡聚糖的靶向合成以及高經濟價值的開發與利用提供一定的理論依據。