益生菌與益生元組合的篩選及體外發酵特性研究

李雅麗,王默涵,趙雯,段素芳,劉偉賢,陳萌,劉義鳳,段盛林*,洪維鍊*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京,100015) 2(功能主食創制與慢病營養干預北京市重點實驗室,北京,100015)3(內蒙古伊利實業集團股份有限公司,內蒙古 呼和浩特,010110)4(內蒙古乳業技術研究院有限責任公司,內蒙古 呼和浩特,010110)

益生菌是對人體有益的微生物的統稱,其中占比最大的是乳酸菌。乳酸菌能發酵碳水化合物產生大量乳酸,在自然界中的分布極其廣泛,至今已發現至少18個屬,共計200余種[1]。被人們熟知的乳酸菌主要集中在乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌屬等[2]。除極少數外,絕大部分乳酸菌都被人體所必需,可定殖于人體腸道,具有抑制有害菌生長、改善腸道微環境、增強免疫系統功能等多種益生功能[3]。正因其顯著促進人體健康的功能特性,聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization,FAO/WHO)將乳酸菌定義為益生菌,廣泛應用于食品工業[4]。在益生產品的開發中,制品中的乳酸菌必須達到足夠的活菌數才能獲得預期的益生功效,且需要確保其通過消化道后仍可大量存活[5]。此外,乳酸菌在腸道發酵產生的乳酸及其他短鏈脂肪酸可顯著改善腸道微環境從而達到保健效果[6]。因此,如何促進乳酸菌增殖、產酸及其發酵特性研究成為食品研發工作者關注的重點。

益生元是指不可被人體消化利用但可選擇性促進腸道益生菌增殖和代謝的碳水化合物,首次由國際“益生元之父”格倫·吉布索于1995年提出[7]。益生元對宿主腸道健康起重要作用,添加一定量的益生元可增強乳酸菌功能[8]。目前被廣泛認可的益生元有低聚果糖和低聚半乳糖,其他益生元的研究雖然相對較少,但它們都具有人體不能分解但可被乳酸菌利用的特殊糖苷鍵。BOGER等[9]的研究表明,當以低聚果糖為唯一碳源時,唾液乳桿菌W57的生長情況較差,但低聚果糖可顯著促進副干酪乳桿菌W20的生長增殖。可見,不同乳酸菌對特定益生元的嗜好性存在較大差異。

基于以上特性,益生菌與益生元結合使用的生物制劑或微生態制劑又被稱為合生元[10]。合生元以協同增效的形式相結合,益生元為益生菌提供營養,選擇性刺激其生長、激活代謝,賦予益生菌在腸道中的競爭優勢,從而有益地影響宿主[11]。研究結果顯示,補充合生元能夠提高益生菌通過消化道時的存活率,使之更有效地定殖于結腸[12]。因此,合生元常被用做膳食補充劑添加于各類食品中,用于維持腸道穩態和人體微生態健康。

由于益生菌對益生元嗜好性的不同,為探究合生元的最佳組合,本研究選擇乳雙歧桿菌BL-99、嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22等4種益生菌,及低聚半乳糖、低聚果糖、棉子糖、低聚木糖、低聚甘露糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖、異構化乳糖、乳糖、抗性糊精、聚葡萄糖、塔格糖等12種益生元,通過微生物菌落自動化工作站高通量篩選生長速率較為典型的組合。4株實驗菌株均已在先前研究中進行菌種水平鑒定研究[13-14],為對照其益生作用,本研究引入市售經典益生菌菌株乳雙歧桿菌BB-12和鼠李糖乳桿菌LGG作為對比。分析各典型組合中益生元對益生菌的促增殖和促產酸能力,通過測定益生元的降解率及發酵液中代謝產物乙酸、乳酸的濃度分析各組合體外發酵特性,以期為合生元產品配伍及食品開發奠定數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 益生菌及益生元

研究所用益生菌及益生元樣品信息如表1所示。

表1 益生菌及益生元樣品信息Table 1 Sample information of probiotics and prebiotics

1.1.2 試劑

NaCl、甲酸、正丁醇、3,5-二羥基甲苯、乙醇、濃硫酸,均為分析純,天津永大化學試劑有限公司;蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、吐溫80、K2HPO4·7H2O、CH3COONa·3H2O、檸檬酸三銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、瓊脂粉,國藥集團化學試劑有限公司;乙酸、乳酸、丙酸、異丁酸、丁酸標準品,均為色譜純,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。實驗用水符合GB/T 6682—2016《分析實驗室用水規格和試驗方法》一級水指標。

1.2 儀器與設備

FE20型pH計、AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;Blue Pard隔水式培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;DL-CJ-2 ND I型潔凈工作臺,北京東聯哈爾儀器制造有限公司;Spectra Max i3酶標儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;2010 Plus氣相色譜儀,島津儀器有限公司;Rotor HDA微生物菌落自動化工作站,英國Singer公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制

計數培養基：MRS液體培養基。參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》配制。

活化培養基：改良的MRS液體培養基。將原MRS培養基的緩沖劑乙酸鈉用2.0 g/L Na2HPO4·12H2O代替,避免發酵過程中由于緩沖體系產生乙酸而影響發酵代謝產物分析。同時加入0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽作為還原劑保證菌落生長的厭氧環境。

增殖固體培養基：向不含葡萄糖的活化培養基中加入瓊脂至15 g/L,121 ℃高壓滅菌15 min;配制0.4 g/mL的益生元母液(益生元濃度均按照有效純度計算),無菌操作下過0.22 μm濾膜后分別加入滅菌培養基中至5 mg/mL;倒入Singer Rotor HAD高通量篩選設備中待用。

發酵液體培養基：不含葡萄糖的活化培養基121 ℃高壓滅菌15 min后,分裝于15 mL離心管中,按照增殖固體培養基的相同方法配制以各益生元為單一碳源的液體培養基。

1.3.2 菌種活化

將冷凍保藏的0.1 g益生菌凍干粉接入活化培養基中,充分振蕩使菌體混合均勻,厭氧條件下37 ℃振蕩培養24 h。所得菌液按體積分數10%接入新的活化培養基,37 ℃厭氧培養24 h,得到菌種母液。

1.3.3 不同培養基中益生菌生長曲線的高通量測定

將108CFU/mL活化后的菌液接入96孔母板,微生物菌落自動化工作站將母板樣品對應接種至增殖固體培養基,而后置于37 ℃中厭氧培養,每隔一定時間拍照分析菌落尺寸,各菌落尺寸隨時間變化的曲線即為該菌的生長曲線,生長曲線的斜率為該菌的生長速率。

1.3.4 益生元對益生菌促增殖及促產酸能力的測定

將活化后的菌液按體積分數1%接入發酵液體培養基中,厭氧條件下37 ℃連續培養48 h,分別于第0、6、20、30、48 h測定OD600值和pH值,并以不含碳源的發酵液體培養基為陰性對照,以未接種菌液的發酵液體培養基為空白對照,以葡萄糖為唯一碳源的發酵液體培養基為陽性對照,分析發酵過程中益生元對益生菌促增殖和促產酸能力的影響。

1.3.5 益生元降解率的測定

參照GB 4789.34—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗》附錄B糖降解率檢測：薄層色譜法中的方法進行。以甲酸∶正丁醇∶水=6∶4∶1(體積比)為展開劑,準確稱取900 mg 3,5-二羥基甲苯溶于25 mL水中,加入375 mL無水乙醇,冰浴中緩慢加入50 mL濃硫酸,作為顯色劑,點樣0.2 μL進行薄層層析。用TLC軟件對層析圖進行處理,生成Excel文件。益生元的降解率按公式(1)計算：

(1)

式中：A0, 0 h的灰度平均值；A48,48 h的灰度平均值。

1.3.6 代謝產物的測定

分別測定各組合0、6、12、24、30 h發酵液中乙酸和乳酸濃度。準確吸取2 mL發酵液于2 mL 的0.25 g/mL磷酸溶液中,振蕩混勻,靜置半小時后通過0.22 μm濾器注入進樣瓶,通過氣相色譜分析乙酸和乳酸產量。分別配制質量濃度為1、100、200、300、400、500 μg/mL的乙酸標準溶液和質量濃度為1、10、20、30、40 mg/mL的乳酸標準溶液。氣相色譜載氣(氮氣)流速1.0 mL/min,進樣口和檢測器溫度均為240 ℃,進樣量1 μL,起始柱溫90 ℃,保留0.5 min后10 ℃/min升溫至110 ℃保留2 min,6 ℃/min升溫至130 ℃保留0 min,10 ℃/min升溫至200 ℃保留5 min,15 ℃/min升溫至230 ℃保留2 min,方法共計23.83 min。得到乙酸和乳酸的標準曲線分別為：y=33 794x-1 590.5(R2=1)和y=20 853x+267.46(R2=1)。

1.4 數據統計分析

本研究的所有組合均設計了2個生物學重復并進行平行測定。數據使用SPSS 22.0進行單因素方差分析和Duncan法多重比較,以P<0.05表示差異顯著。圖片均采用Excel 2016 軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 益生菌與益生元組合的體外篩選

2.1.1 不同培養基中益生菌生長曲線的高通量測定

微生物菌落自動化工作站各培養基中益生菌生長速率如表2所示。使乳雙歧桿菌BL-99生長速率較快的益生元有低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖、乳糖;使嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496生長速率較快的益生元有乳糖;使乳雙歧桿菌BB-12生長速率較快的益生元有低聚異麥芽糖;使副干酪乳桿菌K56生長速率較快的益生元有棉子糖、低聚甘露糖、水蘇糖、異構化乳糖、乳糖;使副干酪乳桿菌ET-22生長速率較快的益生元有水蘇糖;使鼠李糖乳桿菌LGG生長速率較快的益生元有低聚甘露糖、水蘇糖。綜合來說,本研究中的4株實驗菌種與益生元組合后,與商業益生菌相比,最大生長速率均高于乳雙歧桿菌BB-12,而與鼠李糖乳桿菌LGG相比,僅乳雙歧桿菌BL-99與乳糖或水蘇糖組合的生長速率可與之相當,其余3株菌的生長速率均低于鼠李糖乳桿菌LGG。

益生元促進益生菌生長增殖的機理是菌體可通過分泌相關酶將益生元分解為基礎營養物質,以促進其生長繁殖與代謝[15]。由于每種益生菌含有的基因不同導致表達產生的酶系不同,因而對不同益生元的嗜好性差異較大,即體現出不同的生長速率。即使是同種菌株(如本研究中的乳雙歧桿菌BL-99和嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56和副干酪乳桿菌ET-22)基因數量、分泌酶活性和利用方式也可能不同而反映出對同一益生元的利用效率不同[16]。同屬雙歧桿菌的3株益生菌均在以聚葡萄糖為唯一碳源的培養基中均無法生長,在以塔格糖為唯一碳源的培養基中生長速率也很低,而副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌則可以生長,表明不同屬的益生菌代謝途徑和分泌酶系不同。而同屬雙歧桿菌的乳雙歧桿菌BL-99和嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496生長趨勢類似,但生長速率仍存在差異,體現出益生菌對益生元嗜好性篩選的必要性。

高通量篩選、計算生長速率作為一種便捷篩選和精簡測試組數的手段,基于以上結果和市場上常見復配組合,進一步選擇乳雙歧桿菌BL-99與低聚果糖、低聚木糖、乳糖、水蘇糖的組合,嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496與低聚半乳糖、異構化乳糖、乳糖、水蘇糖的組合,副干酪乳桿菌K56與低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水蘇糖的組合,副干酪乳桿菌ET-22與低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水蘇糖的組合進行后續實驗。

表2 不同益生元對益生菌生長速率的影響 單位：h-1

2.1.2 益生元對益生菌促增殖能力分析

益生元對益生菌的促增殖能力通常以發酵液的OD600值作為指標以評價菌體數量,結果如圖1所示。相較于陰性對照,4種益生元均對益生菌有顯著促增殖作用,且4種益生元作用效果有顯著差異。對乳雙歧桿菌BL-99促增殖效果較好的益生元是低聚果糖與乳糖;對嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496促增殖效果較好的益生元是低聚半乳糖與乳糖,而異構化乳糖起效速度略慢;對副干酪乳桿菌K56促增殖效果較好的益生元是低聚半乳糖;對副干酪乳桿菌ET-22促增殖效果較好的益生元是水蘇糖與低聚半乳糖。

與本研究結果類似,PéREZ-CONESA等[17]研究也發現低聚半乳糖和低聚果糖能促進多種雙歧桿菌的生長,這可能與雙歧桿菌屬可產生β-呋喃果糖苷酶和β-半乳糖苷酶且活性較高有關。低聚半乳糖也可極大地促進本研究中2種副干酪乳桿菌的增殖,表明它們也可產生高活性的半乳糖苷酶,而副干酪乳桿菌ET-22可能因為高產α-半乳糖苷酶而可以高效利用水蘇糖[16]。

2.1.3 益生元對益生菌促產酸能力分析

益生菌在代謝益生元快速生長的同時會產生短鏈脂肪酸,能有效降低培養環境的pH值[18]。在人體中,適宜的腸道微環境pH值有助于維持益生菌的黏附能力,直接促進它的定殖和生長,腸道微環境pH值的降低也可通過抑制有害菌的生長增殖而間接促進乳酸菌的生長繁殖[19]。

如圖2所示,相較于陰性對照,4種益生元均對益生菌有顯著促產酸作用,且4種益生元作用效果有顯著差異。4種益生元對實驗菌種的促產酸規律與促增殖規律基本一致,即對乳雙歧桿菌BL-99促產酸效果較好的益生元是低聚果糖與乳糖;對嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496促產酸效果較好的益生元是低聚半乳糖與乳糖,異構化乳糖起效速度略慢;對副干酪乳桿菌K56促產酸效果較好的益生元是低聚半乳糖;對副干酪乳桿菌ET-22促產酸效果較好的益生元是水蘇糖,低聚半乳糖、低聚甘露糖與低聚木糖促產酸效果差異不顯著。由促生長效果數據分析,低聚甘露糖對副干酪乳桿菌ET-22的促生長效果好于低聚木糖,但促產酸效果差異不顯著,說明低聚甘露糖促進菌落生長的同時主要產生的可能是酸類物質以外的代謝產物。

a-雙歧桿菌BL-99;b-嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496;c-副干酪乳桿菌K56;d-副干酪乳桿菌ET-22圖1 不同益生元對益生菌OD600值的影響Fig.1 Effect of different prebiotics on the OD600 nm of probiotics

a-雙歧桿菌BL-99;b-嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496;c-副干酪乳桿菌K56;d-副干酪乳桿菌ET-22圖2 不同益生元對益生菌pH值的影響Fig.2 Effect of different prebiotics on the pH value of probiotics

2.2 不同合生元組合的體外發酵特性研究

2.2.1 不同益生菌對益生元的降解率

采用薄層色譜法分析不同益生菌對益生元的降解率。研究中使用的益生元均為單糖或多糖類物質,可與3,5-二羥基甲苯結合顯色,而有機酸等代謝產物無法與該顯色劑結合。以0 h未發酵的原培養液為陰性對照,發酵48 h的培養液與陰性對照相比若灰度降低則表明糖原被降解。幾種特征組合中益生元降解率的薄層色譜圖如圖3所示。低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚木糖是多種聚合度的混合物,在薄層色譜上會顯示多個點位,與兩側的陰性對照相比,各組合中的益生元被不同程度降解,且不同益生元作用有顯著差異。

圖3 四株益生菌對不同益生元的代謝降解率(薄層色譜圖)Fig.3 Metabolic degradation rate of different prebiotics by four strains of probiotics(thin layer chromatogram)注：C表示0 h未發酵的原培養液,即陰性對照;中間為發酵48 h的培養液;每個菌株點2個重復樣品,每個樣品點2次平行

掃描后的圖片經TLC軟件處理可以得到各列灰度的平均值,按照1.3.5中的方法來量化益生元的降解率,結果如表3所示。乳雙歧桿菌BL-99和嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496對乳糖的降解率最高,對水蘇糖的降解率最低,副干酪乳桿菌K56對益生元的降解率從高到低依次為低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚木糖、水蘇糖,而副干酪乳桿菌ET-22對益生元的降解率從高到低依次為低聚甘露糖、低聚半乳糖、水蘇糖、低聚木糖,表現出不同副干酪乳桿菌菌株對相同益生元的代謝速率不同。

表3 不同益生菌對益生元的降解率 單位：%

2.2.2 發酵代謝產物分析

表4列出了部分實驗菌株對應的嗜好益生元發酵體系,經過48 h發酵,發酵液中乙酸及乳酸的最大產生量。由表4可知,不同的益生元對菌株的促產乙酸及乳酸效果顯著不同。如乳糖對于雙歧桿菌BL-99產生乳酸效果非常顯著,但低聚木糖對于雙歧桿菌BL-99產生乙酸效果更好。低聚半乳糖對于副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22產生乳酸效果非常顯著,但水蘇糖、低聚木糖對于2種菌產乙酸效果更好。綜合乙酸和乳酸的最大產生量,得到乳雙歧桿菌BL-99與乳糖組合的生長效果較好,而嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22則與低聚半乳糖組合的生長效果較好,乳雙歧桿菌BL-99和副干酪乳桿菌K56的結果與益生元降解率的結果相同,而副干酪乳桿菌ET-22與低聚甘露糖雖然有最大降解率,但乙酸和乳酸的產生量不及低聚半乳糖,這與促增殖、促產酸的結果相似,印證了副干酪乳桿菌ET-22與低聚甘露糖組合可能產生更多的是乙酸及乳酸以外的物質。

表4 益生元對益生菌發酵體系中乙酸及乳酸最大產量的影響Table 4 Effect of prebiotics on the maximum yield of acetic acid and lactic acid in the fermentation system of probiotics

3 結論

本研究通過微生物菌落自動化工作站高通量篩選、促增殖及促產酸能力分析、益生元降解率分析、發酵代謝產物分析等方法,研究了雙歧桿菌BL-99、嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22共4株益生菌與12種益生元的體外發酵特性,得到了差異顯著的實驗結果。考慮到體外生長速率、促產酸及促增殖能力評價對益生菌、益生元組合的體外篩選具有一定局限性,故以發酵代謝產物及益生元降解率為主要評價指標,得到乳雙歧桿菌BL-99與乳糖組合的效果較好,嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22與低聚半乳糖組合的效果較好,且與商業菌株乳雙歧桿菌BB-12和鼠李糖乳桿菌LGG相比,本研究中的益生菌具有相當甚至更高的生長速率,可為本實驗中菌株的后續研究與產品開發提供基礎數據支持。