Rothmund-Thomson綜合征一例基因檢測分析

邸文柯 趙 晴 王真真 付希安 孫樂樂 于功奇 劉 紅 張福仁

山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院(山東省皮膚病醫院)，山東省皮膚病性病防治研究所，濟南，250022

Rothmund-Thomson綜合征(RTS)是一種常染色體隱性遺傳病，主要表現為皮膚異色癥、身材矮小、毛發稀疏、青少年白內障、骨骼異常、早衰傾向，并易發生腫瘤，特別是骨肉瘤[1]。RTS于1868年由德國眼科醫生Rothmund最先描述；1936年，英國皮膚科醫生Thomson報道了3例類似的患者；1957年，Taylor將其定義為Rothmund-Thomson綜合征。RTS是一種罕見的疾病，目前共報道400余例[2]。根據RTS的臨床表現及致病基因，RTS可分為兩種類型，Ⅰ型RTS主要表現為皮膚異色癥、外胚層發育不良及青少年白內障，由ANAPC1基因突變所致[3]；而Ⅱ型RTS以皮膚異色癥及骨骼異常為特征，其致病基因為RECQL4。研究發現約60%的RTS患者攜帶RECQL4基因突變，10%的患者攜帶ANAPC1基因突變，另有30%的患者未找到突變。RECQL4基因屬于RecQ DNA解旋酶家族，在維持基因組的完整性和穩定性中發揮重要作用，包括DNA的復制、轉錄及損傷后修復[4]。迄今，約70個RECQL4基因上的突變位點被報道與RTS相關[5]。

我們收集了1個RTS家系，通過全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)進行突變檢測，發現RECQL4基因上攜帶復合雜合突變，并對已報道的RECQL4基因突變位點進行了文獻回顧。

1 對象與方法

1.1 研究對象 在山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院門診收集的一個家系。先證者，女，5歲。自幼面頰部出現暗紅色、褐色斑片，隨后部分皮損發展成網狀點狀色素沉著及萎縮性色素脫失斑；隨后皮損漸增多，累及軀干、臀部，對稱分布(圖1)；伴光敏。患兒自幼身材矮小，體重較同齡兒輕，發育遲緩。無骨骼發育畸形、先天性白內障等并發癥。患兒父母均體健，否認近親結婚。初步診斷為Bloom綜合征。為進一步明確診斷及確定致病基因，進行WES測序。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 本研究經山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會批準，在簽署知情同意書后，抽取患兒及父母外周血各2 mL，-80℃保存。利用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組DNA，利用全波長紫外/可見光掃描分光光度計ND-8000(Thermo Fisher，美國)測定其濃度及純度，并將其標化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 全外顯子測序 基因組DNA經Bioruptor Pico超聲破碎儀隨機打斷成長度為150～200 bp的片段進行建庫，所構建的文庫濃度需大于25 ng/μL。使用Illumina NovaSeq 6000平臺進行測序。利用FastQC進行質控。利用BWA v0.7.17軟件將測序結果與參考序列hg39進行比對，再利用GATK v4.0.12.0對結果進行進一步過濾。

1.2.3 Sanger測序 利用Sanger測序對WES結果進行驗證。利用NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)進行引物設計，后合成引物(華大基因科技有限公司，北京)。利用設計的引物通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)對RECQL4基因相應的外顯子進行擴增。利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，并通過醋酸鈉乙醇沉淀法對PCR產物進行純化。隨后，進行測序PCR反應，并利用ABI 3500XL基因分析儀對純化后的測序PCR產物進行測序。

1.2.4 突變分析 通過1000 Genomes Project、Exome Aggregation Consortium及gnomAD數據庫對WES中發現的突變進行過濾。利用SIFT、polyphen2對突變進行預測，并在已有的364個內部對照中進行驗證。利用Chromas軟件對Sanger測序結果進行分析，并經NCBI blast數據庫進行分析對比。

2 結果

先證者的WES測序發現其在RECQL4基因上攜帶復合雜合突變，其中一個為在第1579位插入一個堿基腺嘌呤(c.1579dupA)，造成移碼突變(p.T527fs)，另一個為第2290位胞嘧啶突變為胸腺嘧啶(c.2290 C>T)，導致第764位氨基酸由谷氨酰胺變為終止密碼子(p. Q764X)。上述兩個突變在三個公共數據庫(1000 Genomes Project、Exome Aggregation Consortium及gnomAD)中均未見報道，且上述突變在我們已有的364個內部對照中均未被發現。通過Sanger測序證實該患兒攜帶RECQL4基因上的復合雜合突變，其中突變c.1579dupA來自患兒的母親，c.2290 C>T來自患兒父親(圖2)。通過查閱文獻，目前共報道78個RECQL4基因的突變與RTS相關(圖3)。

圖1 面部(1a、1b)、腹部(1c)及臀部(1d)可見對稱分布的色素沉著斑及色素減退斑

2a、2b：先證者；2c：先證者母親；2d：先證者父親

圖3 Rothmund-Thomson綜合征RECQL4基因突變譜，紅色字體為本例患兒攜帶的突變

3 討論

1999年，Kitao等[6]首次通過候選基因研究發現RTS患者攜帶RECQL4基因突變。RECQL4基因于1998年被首次報道[7]，位于8號染色體長臂24.3，是RecQ解旋酶家族成員之一。除RTS外，RECQL4基因突變還與Baller-Gerold綜合征及RAPADILINO綜合征相關[8]。Baller-Gerold綜合征主要表現為骨骼發育不良、身材矮小及顱縫早閉；RAPADILINO綜合征以骨骼異常為特點，而沒有皮膚異色癥的表現[9]。因此，通過患者的臨床表現，不難區分。目前，已發現超過100個RECQL4基因的突變與上述三種疾病相關[5]。

RECQL4蛋白由1208個氨基酸組成[5]，可分為不同的結構域，與RecQ解旋酶家族中的其他成員相比較，RECQL4蛋白中的超家族Ⅱ解旋酶結構域(SF2)為家族成員所共有，其氨基端和羧基端為RECQL4蛋白特異的。RECQL4蛋白氨基端存在Sld2樣結構域，可參與DNA復制起始，研究發現，敲除Recql4基因的小鼠將在胚胎時期死亡[10]，而保留Recql4基因氨基端，小鼠可以存活。此外，RECQL4包含兩個核定位信號區域，其中一個位于RECQL4蛋白的起始部位，為線粒體定位信號，與該蛋白在線粒體中的定位相關；另一個位于第420位氨基酸及第463位氨基酸之間的區域，與該蛋白從線粒體上釋放相關，因此，RECQL4也參與線粒體DNA的合成。RECQL4蛋白在DNA損傷修復中發揮關鍵作用，其中第363位氨基酸至第492位氨基酸區域在RECQL4蛋白募集至DNA損傷區域發揮重要作用，并可與BLM蛋白相互作用。BLM不會影響RECQL4募集，但可影響RECQL4在DNA損傷區域的停留，同時，RECQL4也可提高BLM活性。此外，第470位氨基酸至第820位氨基酸構成的SF2結構域及RECQL4蛋白的羧基端也參與DNA損傷修復。RECQL4蛋白包括兩個鋅結合區域，其中一個為第397位氨基酸至第421位氨基酸區域，另一個為其羧基端第836位氨基酸至第1044位氨基酸之間的區域。綜上，可以看出RECQL4蛋白可通過不同功能域發揮獨特的功能，其編碼基因上不同的致病突變可導致其不同的功能受損。但當變異發生在RECQL4蛋白的氨基端，可影響該蛋白在DNA復制起始中的作用，是致死性的，因此，尚未有該結構域純合突變的報道[11]；而當致病變異發生在SF2結構域，雖然變異對RECQL4蛋白有害，但可存活，在目前報道的與RTS相關的RECQL4基因上的致病突變，約60%位于SF2結構域。本例患兒攜帶的兩個突變，其中，突變位點c.2290 C>T已被報道[2]，而 c.1579dupA尚未有報道，這兩個突變位點均位于SF2結構域，因此，可能影響RECQL4蛋白參與DNA損傷修復。

RTS患者有不同的臨床表型，當患者未發生腫瘤時，其預期壽命不會被影響。因此，建立RTS患者致病突變與是否會發生腫瘤之間的聯系尤為重要。2003年，Wang等[12]對33例臨床診斷為RTS患者的RECQL4基因進行分析，其中23例患者攜帶該基因的突變。同時，在33例RTS患者中，11例發生骨肉瘤。通過基因型-表型分析發現，攜帶可造成RECQL4截短蛋白突變的患者發生骨肉瘤的風險明顯升高。2018年Colombo等[11]報道攜帶非解旋酶結構域突變的患者的臨床表現通常較輕，主要表現為皮膚異色癥，而攜帶解旋酶結構域突變的患者更容易發生腫瘤。本例患兒攜帶的兩個突變均位于RECQL4蛋白的解旋酶結構域，其中，突變c.2290 C>T可形成截短蛋白，既往報道的攜帶該突變的患兒表現為臀部及四肢的皮膚異色，睫毛和眉毛的缺失，未有腫瘤的發生，而本例患兒除表現為軀干皮膚異色外，伴有發育遲緩，尚未發現有腫瘤的發生，應當對患者進行密切監測。

目前，RTS尚無統一的診斷標準。Wang等[13]提出，當患者出現頭發、眉毛、睫毛的稀疏，身材矮小，先天性骨骼發育異常，牙齒和指甲異常，皮膚異色癥，白內障和腫瘤時，應考慮RTS的可能。Pujol等[14]則認為，當患者同時出現骨肉瘤和皮膚異色癥的表現時，應高度懷疑是否為RTS。同時，在出現特征性表現的患者中應進行RECQL4基因的檢測。本例患兒在初診時診斷為Bloom綜合征。Bloom綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，其致病基因為RecQ解旋酶家族中的BLM基因[15]。Bloom綜合征的患者通常在出生時表現為面部紅斑；2歲后，可表現出光敏性，并出現面部蝶形紅斑；此外，在軀干和四肢可以見到色素沉著和色素減退斑。同時，患者易發生感染，其發生腫瘤的風險較正常人高150～300倍。RTS與Bloom綜合征的臨床都可表現為面部紅斑、身材矮小等，但通過基因檢測可對二者進行鑒別[16]。

本文報道一個RTS家系，通過WES及Sanger測序發現患兒在RECQL4基因上攜帶一個移碼突變(c.1579dupA)和一個無義突變(c.2290 C>T)，其中c.1579dupA未被報道。因此，本研究豐富了疾病基因庫，也為該家系的遺傳咨詢提供幫助。