滋腎降糖丸治療糖尿病骨質(zhì)疏松的作用機制探索

連李榮 楚淑芳 梁家暢 李惠林 趙恒俠* 董彥敏

1.廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510000 2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000 3.廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510000

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一組以長期高血糖為主要特征的代謝綜合征，到2035年全球DM患病人數(shù)預計增加到5.92億，我國更是DM發(fā)病大國，患病率約為10.4 %[1]，其中約33 %[2]的DM患者因骨代謝異常并發(fā)糖尿病骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis，DOP)，DOP往往伴有疼痛及運動功能障礙，骨折風險增加[3]，是導致DM患者殘疾的重要原因之一。

滋腎降糖丸(Zishen Jiangtang Pill，ZJP)(專利號：ZL201610308238X)是深圳市中醫(yī)院自行研發(fā)的中藥復方制劑(批準文號：粵z20070085)，由黃芪、牛膝、淫羊藿、龜板、鱉甲、龍骨、牡蠣、熟地黃、生地黃、黨參、骨碎補、五味子、三七、黃精所組成，具有益氣養(yǎng)陰、滋腎壯骨的作用，臨床研究表明ZJP具有降糖[4]、提高胰島素敏感性[5]、改善骨代謝[6]等作用，動物實驗研究也已證明其可通過Wnt/β-catenin通路促進成骨細胞的分化[7]，恢復 miR-26a-5p表達[8]，影響骨代謝防治DOP。現(xiàn)為進一步深入探索ZJP治療DOP的作用機制，遂利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接的方法為其提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 ZJP主要成分及靶點預測

以ZJP的藥名為關鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中按照OB≥30 %、DL≥0.18獲取主要成分及作用靶點，再從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中按Score≥30、P≥0.05查找主要成分及作用靶點，去重后利用UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白進行校正得到ZJP的作用靶點。

1.2 DOP疾病靶點預測

在數(shù)據(jù)庫GeneCards和OMIM中，以關鍵詞“Diabetic osteoporosis”檢索其相關靶點，去重合并得到疾病的相關靶點。

1.3 ZJP作用于DOP的靶點預測

將ZJP的作用靶點與DOP疾病靶點通過Venny系統(tǒng)取交集預測ZJP作用于DOP的靶點。

1.4 活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

將ZJP主要活性成分及ZJP作用于DOP的靶點形成網(wǎng)絡關系文件，導入Cytoscape(3.7.2)軟件，獲得活性成分-靶點網(wǎng)絡圖，并將網(wǎng)絡關系文件中活性成分按度值大于30為篩選條件獲取關鍵活性成分。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡構建

將ZJP作用于DOP的靶點ID，導入String在線平臺，獲取文件并導入Cytoscape(3.7.2)軟件，獲得蛋白互作網(wǎng)絡，并將排名前20的關鍵基因繪制條形圖，利用插件CytoNCA計算每個節(jié)點的打分，將分值較高的節(jié)點再次構建網(wǎng)絡，得到網(wǎng)絡核心靶點。

1.6 GO功能及KEGG通路富集分析

將ZJP作用于DOP的靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，設置P<0.01，得到GO功能和KEGG通路富集分析結果。

1.7 ZJP關鍵藥物活性成分-核心靶點分子對接

將PPI網(wǎng)絡核心靶點與ZJP中關鍵活性成分進行匹配，從PubChem數(shù)據(jù)庫下載ZJP小分子配體2 D結構，利用ChemOffice軟件將其轉(zhuǎn)化為3 D結構，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索核心靶點蛋白ID，并根據(jù)ID號從PDB數(shù)據(jù)庫中搜索其3 D結構，運用Pymol軟件去除蛋白結構的水分子及小分子配體，并在AutoDockTools中進行加氫、尋找活性口袋等預處理，最后運用VINA軟件進行二者分子對接，并分析其結合活性。

2 結果

2.1 ZIP-DOP靶點預測

經(jīng)Venny對ZJP的330個作用靶點與DOP的2 708個疾病靶點取交集后，得到ZJP作用于DOP的靶點151個，并繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 ZJP與DOP共同靶點基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram after the intersection of ZJP and DOP

2.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡分析

利用Cytoscape(3.7.2)構建活性成分-靶點視化圖形(圖2)，其中ZJP主要活性成分236個，并以度值大于30為條件篩選出槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇5個藥物關鍵活性成分，詳見表2。

注：A：(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol； B：(8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-1,2,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-one； C：(9aS)-2,5,9,9-tetramethyl-3,4,6,7,8,9a-hexahydrobenzo[7]annulene； D：(Z)-2-methyl-5-[(1S,2R,4R)-2-methyl-3-methylene-2-norbornanyl]pent-2-en-1-ol； E：6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno[3,4-h]isoquinolin-2-ium。圖2 DOP-ZJP-主要活性成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig.2 DOP-ZJP-main active ingredient-target network diagram

表2 度值大于30的5個關鍵活性成分

2.3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡構建及核心靶點收集

利用Cytoscape(3.7.2) 得到PPI蛋白互作網(wǎng)絡(圖3)，并將前20名靶點繪制條形圖(圖4)，再通過CytoNCA篩選得出IL-6、TNF、JUN、VEGFA、EGFR等16個核心作用靶點(圖5)。

圖3 靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖Fig.3 Target protein interaction network diagram

圖4 靶點條形圖Fig.4 Target bar chart

圖5 核心靶點圖Fig.5 Core targets

2.4 GO功能及KEGG信號通路分析

在GO功能富集分析中得到條目66條(P<0.01)，選擇排名前20繪制條形圖(圖6)，主要涉及核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA相關轉(zhuǎn)錄激活器活性、RNA特異性聚合酶Ⅱ、類固醇受體活性等。KEGG富集得到信號通路104條，選擇排名前20條繪制氣泡圖(圖7)，主要涉及流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、細胞凋亡信號通路等。

圖6 GO功能富集分析條形圖Fig.6 Barchart of GO enrichment analysis

圖7 KEGG信號通路富集分析氣泡圖Fig.7 Bubblechart of KEGG enrichment analysis of signal pathway

2.5 分子對接

選取ZJP中的關鍵活性成分與排名前6的核心基因進行匹配及分子對接(見圖8)，結合能均≤-6.0 kcal/mol，口袋匹配度較好，構象穩(wěn)定，結合活性較高展現(xiàn)出良好的結合力。其中IL-6與quercetin a環(huán)與Val93形成疏水作用；b環(huán)與Val93形成π-sigma作用，與Thr120形成氫鍵作用；c環(huán)與Thr120形成酰胺-π堆積效應，與Pro95、Val93、Pro121形成疏水作用，與Thr125形成氫鍵作用，詳見圖9。

圖8 分子對接結合能量表Fig.8 Molecular docking binding energy scale

3 討論

DOP在中醫(yī)學中并無專屬的病名，多屬“消渴”合并“骨痿”、“骨痹”等范疇，《丹溪心法》[9]曰：“消渴腎虛受之，腿膝枯細，骨節(jié)痠疼”，消渴可引起骨痿的發(fā)生，發(fā)病與腎虛密切相關。ZJP整體亦以補腎為法，方中熟地黃精填骨髓，補益真陰；五味子補虛強陰，加之龜板、鱉甲血肉有形之品相配伍，四者共奏滋陰養(yǎng)血，益腎健骨之功。牛膝除寒濕痿痹，淫羊藿堅筋骨補腰膝，骨碎補入腎理骨病，牡蠣強骨節(jié)，《雷公炮炙藥性解》[10]又云“腎主骨，宜龍骨獨入之”，遂諸藥合之以補肝腎，強筋骨。再取黃芪、黨參、黃精補氣健脾頤養(yǎng)后天之本，脾腎共濟，共達益氣養(yǎng)陰、滋腎壯骨之功，以防治DOP。

ZJP-DOP的核心靶點中IL-6與TNF均為炎性細胞因子，二者可刺激骨髓來源的破骨細胞促進破骨細胞的分化[11]，IL-6可促進RANKL的表達[12]，通過RANKL/RANK信號通路誘導破骨細胞的分化成熟，增加骨吸收；TNF-α可通過PI3k/Akt[13]信號通路上調(diào)骨髓造血干細胞(BMHSCs)的P2X7受體，促進BMHSCs分化為大量破骨細胞導致OP。由此推測ZJP治療DOP的途徑可能為降低IL-6、TNF表達，減少RANKL/RANK及PI3k/Akt信號通路的激活，從而抑制破骨細胞的分化，抑制骨吸收改善DOP。VEGF是一種與肝素結合的同型二聚體蛋白，VEGF[14]的表達可促進骨內(nèi)血管的形成，能夠明顯促進BMSCs的增殖并向成骨細胞分化[15]，也可降低破骨細胞溶骨活性[16]來促進骨形成及增加骨密度。mTOR是細胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)因子，其中mTORC1[17]激活可阻止RANKL誘導的骨吸收和骨質(zhì)流失，mTORC2[18]可增加成骨細胞中Sp7、Ibsp和Bglap的表達促進成骨分化，且Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)關鍵活性成分中的山奈酚可通過mTOR途徑促進成骨細胞生成。推測ZJP可增加VEGF及mTOR表達，既可誘導成骨細胞分化促進骨形成，又可抑制RANKL誘導的骨破壞，從而起到防治DOP的作用。雌激素與ESR1結合后激活雌激素信號，進而激活Wnt/β-Catenin信號通路提升成骨細胞活性，其中β-catenin蛋白可抑制PPARγ mRNA的表達[20]，從而使BMSCs向成骨細胞分化能力增強，這與課題組前期發(fā)現(xiàn)ZJP可通過Wnt/β-catenin通路促進骨形成，并下調(diào)PPARγ表達[21]抑制BMSCs成脂分化治療DOP的結論相符。

圖9 IL6與quercetin分子對接圖Fig.9 Molecular docking diagram of IL6 and quercetin

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與其受體(RAGE)結合生成原型輔酶Ⅱ，增強氧化應激反應，激活TNF信號通路中NF-κB信號通路[22]，打破骨髓中骨骼與脂肪的動態(tài)平衡，促進破骨細胞形成與分化，致使成骨細胞形成炎癥性損傷[23]而致DOP，表明ZJP可能通過抑制AGES合成，減少AGE-RAGE及TNF信號通路的激活，抑制破骨細胞形成從而改善DOP。流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路中流體剪切應力(FSS)可引起的鈣瞬變特性從而影響成骨細胞增殖[24]也可促進NFκB向核的轉(zhuǎn)運，降低PPARγ的mRNA表達，抑制成骨細胞的凋亡活性，刺激破骨細胞內(nèi)的凋亡活性[25]以改善DOP，表明ZJP亦可激活此信號通路，促進成骨細胞生成以防治DOP。分子對接結果提示ZJP中的關鍵活性成分與核心靶點均能穩(wěn)定的結合，表明ZJP可通過其關鍵活性成分與核心靶點發(fā)生相互作用而達到治療DPO的目的。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接的研究方法，探討了ZJP的有效成分和作用靶點與DOP疾病靶點的作用關系，揭示了ZJP可能作用于TNF-α、IL-6、VEGF、mTOR、ESR1、PPARG等靶點，通過糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、Wnt/β-catenin、RANKL/RANK等信號通路促進成骨細胞增殖分化與破骨細胞的凋亡，抑制破骨細胞的生成從而治療DOP的分子作用機制，為進一步深入探索ZJP治療DOP的作用機制提供理論依據(jù)。