續(xù)苓健骨顆粒治療腎虛血瘀型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效及轉(zhuǎn)錄機(jī)制研究

謝麗華 柴昊 葉云金 李生強(qiáng) 黃景文 陳娟 陳玄 陳賽楠 葛繼榮*

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)研究室，福建 福州 350003 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)與遺傳、內(nèi)分泌、免疫等方面密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為中老年女性多虛多瘀[1]，有學(xué)者[2]基于“因虛致瘀”理論，提出虛、瘀是PMOP辨證的出發(fā)點(diǎn)。本課題組前期研究[3]也發(fā)現(xiàn)，腎虛血瘀證型在臨床中占比相對(duì)較高。續(xù)苓健骨方是本課題組用于治療PMOP的經(jīng)驗(yàn)方，主治腎虛血瘀證的PMOP。為評(píng)價(jià)該方治療PMOP的療效和安全性，課題組對(duì)PMOP患者進(jìn)行了臨床研究，并用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探討了其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 資料

1.1.1研究對(duì)象：選取2018年7月至2020年9月在福建省中醫(yī)藥科學(xué)院就診的腎虛血瘀型PMOP患者，按隨機(jī)數(shù)表法分為試驗(yàn)組(35例)及對(duì)照組(32例)。由于病人脫落，最后共完成54例，其中試驗(yàn)組27例，對(duì)照組27例。選取6例試驗(yàn)組患者，另選取6例骨密度正常者為健康組用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本研究獲得福建省中醫(yī)藥科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(20180423)。

1.1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)：①西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)(第三稿)》[4]；②中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：按照《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(shí)(2015)》[1]。

1.1.3納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)辨證者；②年齡在50～70歲之間的自然絕經(jīng)者；③自愿參加試驗(yàn)，簽署知情同意書(shū)者。

1.1.4排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有影響骨代謝疾病等繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥者；②合并有腫瘤和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；③肝、腎功能異常者；④近三個(gè)月內(nèi)采用激素替代治療和服用降鈣素，近六個(gè)月內(nèi)有連續(xù)15 d應(yīng)用雙膦酸鹽者。

1.1.5脫落標(biāo)準(zhǔn)：失訪未能按時(shí)服藥者；因主觀原因或出現(xiàn)不良事件主動(dòng)退出者。

1.2 方法

1.2.1治療藥物：續(xù)苓健骨顆粒(專利號(hào)：ZL201 510 784 227.4)由骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、紅花等12味中藥組成，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑室生產(chǎn)、包裝。葡萄糖酸鈣片(國(guó)藥準(zhǔn)字H23020998)、骨化三醇(羅蓋全，國(guó)藥準(zhǔn)字J20150011)。

1.2.2治療方法：基礎(chǔ)治療：兩組均給予葡萄糖酸鈣片，規(guī)格為0.5 g/片，1 g/次，3次/d。試驗(yàn)組：另給予續(xù)苓健骨顆粒，規(guī)格為15 g/袋，1袋/次，3次/d。對(duì)照組：另給予骨化三醇，規(guī)格為0.25 μg /粒，1粒/次，2次/d。療程均為6個(gè)月。

1.2.3療效指標(biāo)：(1)中醫(yī)證候療效：中醫(yī)證候評(píng)分參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中的證候分級(jí)量化。分別記錄治療前、治療后3個(gè)月及6個(gè)月的中醫(yī)證候評(píng)分。(2)骨密度檢測(cè)：運(yùn)用美國(guó)Discovery W型DXA儀(CV=0.245 %)檢測(cè)受試者治療前、治療后6個(gè)月的腰椎(L1～4)、左側(cè)股骨頸及股骨近端的骨密度(bone mineral density, BMD)。

1.2.4安全性指標(biāo)：進(jìn)行一般體格檢查，包括血、尿常規(guī)、心電圖、肝腎功能檢查。

1.2.5轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)處理：抽取空腹患者外周血5 mL，提取細(xì)胞總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。質(zhì)控合格后在高通量測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序，得到原始測(cè)序序列，并與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。計(jì)算出每個(gè)基因在各個(gè)樣本中的表達(dá)量。將P< 0.05、兩組樣品log2FoldChange大于1的基因作為差異表達(dá)基因，進(jìn)一步進(jìn)行KEGG分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

治療過(guò)程中試驗(yàn)組脫落8例，其中3例拒絕服藥，2例因胃腸不耐受脫落，3例主動(dòng)退出；對(duì)照組脫落5例，其中3例拒絕服藥，2例因胃腸不耐受脫落。治療前兩組年齡、絕經(jīng)年齡、身高、體重組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.05)。兩組治療前后血壓、尿常規(guī)、心電圖等無(wú)異常改變。試驗(yàn)組有3例出現(xiàn)肝、腎功能異常，對(duì)照組有2例出現(xiàn)肝、腎功能異常。經(jīng)隨訪觀察，均排除肝腎功異常與本次服藥相關(guān)。

2.1 中醫(yī)療效比較

2.1.1中醫(yī)證候療效及積分比較：中醫(yī)證候療效試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。兩組治療3個(gè)月、6個(gè)月后中醫(yī)證候積分較治療前均顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 兩組中醫(yī)證候療效比較

表2 兩組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較[M(P25,P75)]

2.1.2中醫(yī)臨床癥狀比較：治療前試驗(yàn)組與對(duì)照組比較：下肢痿軟、耳鳴組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)組評(píng)分高于對(duì)照組(P<0.05)，其余組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療3、6個(gè)月后，試驗(yàn)組腰脊疼痛、下肢痿軟、步履艱難、耳鳴評(píng)分較治療前顯著下降(P<0.05或P<0.01)；對(duì)照組治療3個(gè)月后腰膝酸軟、下肢痿軟評(píng)分較治療前顯著下降(P<0.05或P<0.01)，治療6個(gè)月后腰脊疼痛評(píng)分較治療前顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組患者治療前后中醫(yī)癥狀比較[M(P25,P75)]

2.2 骨密度比較

治療前兩組患者骨密度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療前后比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組骨密度變化值(治療后-治療前)比較，治療后兩組骨密度保持穩(wěn)定或呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但組間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組患者治療前后骨密度比較Table 4 Comparison of BMD before and after treatment in the two

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異表達(dá)基因分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，試驗(yàn)組治療前、后有319個(gè)差異基因；試驗(yàn)組治療前與對(duì)照組相比有598個(gè)差異基因，其中19個(gè)差異基因(包括FOSB、H4C2、RAMP3等)在治療后的表達(dá)顯著改變，8個(gè)上調(diào)基因在治療后其表達(dá)明顯下調(diào)，11個(gè)下調(diào)基因在治療后其表達(dá)明顯上調(diào)(見(jiàn)表5)。

2.4 KEGG通路分析

對(duì)19個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)FOSB主要參與破骨細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路；H4C2主要參與中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘捕網(wǎng)信號(hào)通路、RAMP3參與血管平滑肌收縮信號(hào)通路。

表5 19個(gè)差異表達(dá)基因Table 5 19 differentially expressed genes

3 討論

PMOP的發(fā)生與腎、脾、瘀等關(guān)系密切，因此以補(bǔ)腎、健脾、活血為主要治法。續(xù)苓健骨顆粒具有補(bǔ)腎壯骨、活血止痛的功效。本研究結(jié)果表明續(xù)苓健骨顆粒組治療PMOP中醫(yī)證候療效優(yōu)于對(duì)照組，能夠明顯改善臨床癥狀，兩組治療后骨密度保持穩(wěn)定或呈上升趨勢(shì)。與本研究結(jié)果類似，也有研究[5-6]發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在半年內(nèi)提高骨密度效果方面不明顯，但能有效地緩解臨床癥狀。慢性疼痛是PMOP的主要臨床表現(xiàn)，本研究結(jié)果也驗(yàn)證了減輕疼痛、改善臨床癥狀是中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的優(yōu)勢(shì)之一[7-8]。

為了進(jìn)一步探討續(xù)苓健骨顆粒治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，共獲得19個(gè)差異基因，包括FOSB、H4C2、RAMP3等。這些基因主要參與破骨細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路、中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘捕網(wǎng)信號(hào)通路、血管平滑肌收縮信號(hào)通路。IL-17可通過(guò)刺激細(xì)胞表達(dá)RANKL，并且抑制OPG表達(dá)，而發(fā)揮其骨吸收作用[9]。作為IL-17 信號(hào)通路的下游，F(xiàn)OSB是AP1復(fù)合物家族成員之一，AP1復(fù)合物被認(rèn)為是骨骼發(fā)育中的重要調(diào)節(jié)因子[10]。在本研究中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組FOSB基因表達(dá)下調(diào)，經(jīng)續(xù)苓健骨顆粒治療后，F(xiàn)OSB明顯上調(diào)。因此，筆者推測(cè)續(xù)苓健骨顆粒治療PMOP的機(jī)理可能與調(diào)控IL-17/FOSB信號(hào)通路相關(guān)。

RAMP基因編碼的蛋白是降鈣素活性修飾蛋白家族成員之一。RAMP3與CRLR結(jié)合形成二聚體作為腎上腺髓質(zhì)素受體，而腎上腺髓質(zhì)素能刺激成骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)體內(nèi)骨生長(zhǎng)[11]。RAMP3變異會(huì)導(dǎo)致老年婦女骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[12]。RAMP還能參與血管擴(kuò)張[13]。因此，筆者推測(cè)續(xù)苓健骨顆粒可通過(guò)RAMP3改善血瘀，促進(jìn)血管擴(kuò)張；同時(shí)通過(guò)調(diào)控RAMP3參與骨代謝調(diào)節(jié)。H4C2是真核生物中負(fù)責(zé)染色體纖維核小體結(jié)構(gòu)的基本核蛋白。已有研究[14-15]表明組蛋白乙酰化可影響成骨、破骨細(xì)胞的分化及成熟。但是H4C2乙酰化是否影響骨代謝，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述，筆者推測(cè)續(xù)苓健骨顆粒治療PMOP的機(jī)理可能與FOSB、RAMP3、H4C2差異基因以及FOSB參與的破骨細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路相關(guān)。

總之，本研究以補(bǔ)腎活血法治療腎虛血瘀型PMOP，中醫(yī)證侯療效優(yōu)于對(duì)照組，臨床癥狀改善明顯。但本研究的觀察周期較短，在對(duì)骨密度改善以及長(zhǎng)期療效方面值得進(jìn)一步探討，同時(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果也需要更大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。雖然本研究存在一定的局限性，但得出的結(jié)果為今后的研究提供了思路，多組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步也將有利于未來(lái)對(duì)骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的揭示和相關(guān)藥物的研發(fā)。