淫羊藿苷對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞凋亡及炎癥的影響

李藤藤徐東升李 琪吳 迪張 洋任立群*李相軍*

(1.吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室,長春 130021; 2.吉林大學第一醫院腫瘤科,長春 130000)

隨著生活條件的改善和飲食結構的變化,我國心血管疾病的發生率和死亡率迅速增長,據推算,我國現患心血管疾病人數2.9 億,其死亡高于腫瘤和其他疾病,占居民疾病死亡的40%以上,居于首位[1]。 動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種心血管疾病,是由內源性促炎和抗炎失衡所引起的炎癥反應[2-3],涉及脂質沉積、內皮損傷、泡沫細胞堆積和不穩定斑塊的破裂等病理過程[4],不穩定斑塊容易發生破裂并促進血栓形成。 巨噬細胞是斑塊中最重要的免疫細胞,其數量和功能對斑塊的大小和穩定性有直接的影響,并通過分泌多種炎癥因子,進一步介導免疫細胞浸潤不穩定斑塊,引發斑塊內細胞的凋亡和壞死,進而加速不穩定斑塊的破裂[5-7]。 因此,抑制巨噬細胞凋亡及減少促炎因子的分泌對延緩AS 進展有重要意義。

淫羊藿苷(icariin,ICA)是從傳統補益中藥淫羊藿中提取的一種黃酮類化合物,是淫羊藿最為代表性的成分[8],具有抗骨質疏松、抗炎、抗腫瘤和免疫調節等藥理作用[9]。 目前,本課題組已發現,ICA 通過阻斷p38 MAPK 和ERK1/2 信號通路抑制VSMC增殖[10]。 本研究旨在通過體外構建泡沫巨噬細胞模型,探討ICA 對泡沫巨噬細胞凋亡以及炎癥因子分泌的影響,為抗AS 治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細胞

RAW264.7 細胞株(吉林大學生命科學學院實驗室贈送,由吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室凍存)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 高糖培養液(Hyclone 公司,美國);胎牛血清(四季青,浙江天杭生物科技股份有限公司);青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國Gibco 公司);淫羊藿苷(四川維克奇生物技術有限公司,純度98.0%);氧化低密度脂蛋白(ox-LDL,廣州奕源生物科技有限);CCK-8 試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);Hoechst33258 染色試劑盒(南京凱基科技有限公司);油紅O(北京索萊寶科技有限公司);總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司);IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒(上海酶聯)。 TGL-16M 臺式高速冷凍離心機(長沙湘智離心機有限公司);Nikon ECLIPSE 80i 正置顯微鏡(尼康儀器(上海)有限公司);美國伯樂Bio-Rad 垂直電泳轉印系統(上海巴玖實業有限公司);MD 全波長光吸收酶標儀SpectraMax 190(美谷分子儀器(上海)有限公司);4200 全自動化學發光成像分析系統(上海天能);倒置熒光顯微鏡和生物顯微鏡(Nikon 儀器(上海)有限公司);CO2恒溫培養箱(美國BD 公司);JJ260 型精密電子天平。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養和實驗分組

RAW264.7 細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養,第2 天換液繼續培養。 當細胞生長密度至70%～80%時進行傳代培養,2 ～4 代細胞用于實驗。 將培養的RAW264.7 細胞分為空白組(CON 組)、模型組(MOD 組,50 μg/mL ox-LDL)、ICA 低、中、高劑量組(ICA 10、20、40 μmol/L 組+50 μg/mL ox-LDL)。低、中、高濃度的ICA 預處理RAW264.7 細胞30 min 后,模型組和ICA 低、中、高劑量組中加入50 μg/mL 的ox-LDL 培養24 h,空白組不作處理,加入等量的培養液代替。

1.3.2 CCK-8 法檢測細胞活力

使用無血清的DMEM 培養液制備濃度分別為10、20、40 μmol/L 的ICA 工作液。 按照每孔每毫升1.5×104個細胞數將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種到96 孔板中,每孔100 μL,按照1.3.1 培養條件及實驗分組處理,每組設置6 個復孔。 培養24 h 后,向各孔中加入10 μL CCK-8,37℃孵育4 h后,吸去各孔中的培養液,37℃搖床5 min,酶標儀490 nm 波長處檢測各孔的吸光度,細胞活力=實驗組A 值/對照組A 值×100%

1.3.3 Hoechst 33258 檢測細胞凋亡率

將處于對數生長期的RAW264.7 細胞按照每孔每毫升2.0×105個細胞數接種于放有蓋玻片6 孔板中,按照1.3.1 培養條件及實驗分組處理24 h后,棄培養液,用預冷的PBS 洗1 遍,加入500 μL 4%的多聚甲醛固定液進行固定,時間10 ～15 min,棄掉固定液并用預冷的PBS 洗2 遍,加入500 μL Hoechest33258 染色液,搖床搖動5 min 后,棄掉染色液,PBS 洗2 遍,調整顯微鏡的熒光波長,于鏡下仔細觀察并拍照,圓形是正常細胞核的著色形態,呈現淡藍色;凋亡細胞則是致密濃染,呈現亮藍色。1.3.4 油紅O 染色

將處于對數生長期的RAW264.7 細胞按照每孔每亳升2.0×105個細胞數接種于放有蓋玻片的6孔板中,按照1.3.1 培養條件及實驗分組處理24 h后,棄掉培養液,PBS 洗2 遍,加4%多聚甲醛,固定30 min,棄掉多聚甲醛,PBS 洗兩遍,加入2 mL 油紅O 染液,37℃孵育30 min,鏡下觀察,棄掉油紅O 染液,蘇木素復染2～3 min,水洗,甘油明膠封片,鏡下觀察拍照。

1.3.5 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)

將處于對數生長期的RAW264.7 細胞按照每孔每毫升2.0×105個細胞數接種于6 孔板中,按照1.3.1 培養條件及實驗分組處理24 h 后,收集各孔中的培養液并于-80℃保存,嚴格按照ELISA 試劑盒 說 明 書 操 作, 測 定 ICA 對 ox-LDL 誘 導 的RAW264.7 細胞炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 釋放的影響。

1.3.6 免疫印跡實驗(Western blot)

將處于對數生長期的RAW264.7 細胞按照每孔每毫升2.0×105個細胞數接種于6 孔板中,按照1.3.1 培養條件及實驗分組處理24 h 后,棄掉培養皿中的培養液,PBS 洗2 遍,然后收集細胞。提取各組細胞總蛋白時按照提取試劑盒的說明書,采用BCA 定量法,然后進行SDS-PAGE 凝膠電泳,通過濕法轉膜到PVDF 膜上,用脫脂奶粉封閉2 h,加入相應的一抗抗體,4℃冰箱中孵育過夜。第2 天用TBST 洗膜4 次,每次5 min 加入稀釋后的二抗,室溫搖床孵育2 h,TBST 洗膜4 次,每次5 min,按照高敏感度化學發光檢測試劑盒說明書滴加發光工作液顯色后,內參以GAPDH 作為參照,采用Image proplus 6.0 軟件進行灰度分析。Western blot 實驗過程中涉及的抗體及稀釋濃度見表1。 目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

表1 Western blot 法檢測中使用的抗體和稀釋濃度比例Table 1 Antibodies used in Western blot method detection and dilutions

1.4 統計學方法

統計學采用SPSS 23.0 統計軟件進行分析。 計量資料經正態分布和方差齊性檢驗,實驗結果以平均數±標準差(ˉx±s)來表示,多組平均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞活力的影響

給藥處理24 h 后,經CCK-8 法檢測,與CON 組比較,MOD 組細胞活力明顯降低,差異具有統計學意義(P＜0.05);與MOD 組比較,ICA 20、40 μmol/L可以顯著提高細胞活力,具有統計學意義(P＜0.05),ICA 10 μmol/L 組細胞活力增加,但差異無統計學意義(表2)。

表2 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞活力的影響Table 2 Effect of ICA on the viability of RAW264.7cells induced by ox-LDL

2.2 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞凋亡的影響

給藥處理24 h 后,經Hoechest33258 染色觀察,未經藥物處理的CON 組細胞生長狀態良好,細胞核形態均一,整體細胞呈現均勻的藍色熒光;與CON組比較,MOD 組細胞核變形皺縮且發出明顯的藍色熒光,即細胞染色質密集皺縮,出現高亮的凋亡小體,典型凋亡細胞核數目明顯增多,具有統計學意義(P＜0.05);與MOD 組比較,ICA 低、中、高劑量組亮藍色熒光漸弱,高亮的凋亡小體數目逐漸減少,凋亡細胞核數逐漸減少,具有統計學意義(P＜0.05)(表3,圖1)。

圖1 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞凋亡的影響Figure 1 Effect of ICA on RAW264.7 cell apoptosis induced by ox-LDL

表3 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞凋亡的影響Table 3 Effect of ICA on RAW264.7 cell apoptosis induced by ox-LDL

2.3 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞油紅O 染色觀察

藥物處理24 h 后,經油紅O 染色觀察,與CON組比較,MOD 組細胞體積增大且均有油紅O 染色陽性細胞遍布,細胞內脂滴形成,具有統計學意義(P＜0.05);與MOD 組比較,ICA 中、高劑量組油紅O 染色陽性細胞逐漸減少,細胞內脂滴變小且減少,具有統計學意義(P＜0.05),ICA 低劑量組油紅O 染色陽性細胞減少,但差異無統計學意義(圖2)。

注:與CON 組相比,*P＜0.05;與MOD 組相比,#P＜0.05。

2.4 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞炎癥因子釋放的影響

藥物處理24 h 后,收集細胞培養上清,經ELISA測定,與CON 組比較,MOD 組細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α 因子均顯著增加,具有統計學意義(P＜0.05);與MOD 組比較,ICA 10、20、40 μmol/L 處理時可以降低IL-1β、IL-6 和TNF-α 因子的分泌,具有統計學意義(P＜0.05),且呈劑量依賴性(表4)。

表4 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞炎癥因子釋放的影響(ˉx±s,n=3)Table 4 Effect of ICA on the secretion of inflammatory factors in RAW264.7 cells induced by ox-LDL

2.5 ICA 對ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、IκBα 和NF-κB p65 蛋白表達的影響

ICA 濃度為10、20、40 μmol/L 預處理30 min,ox-LDL誘導24 h 后,提取細胞蛋白,經Western blot檢測,與CON 組比較,MOD 組細胞Bax、Caspase-3和NF-κB p65 蛋白表達均顯著增加,Bcl-2 和IκBα蛋白表達顯著下降,差異均有統計學意義(P＜0.05);與MOD 組比較,ICA10、20、40 μmol/L 處理時可以降低Bax、Caspase-3 和NF-κB p65 蛋白的表達,提高Bcl-2 和IκBα 蛋白表達,具有統計學意義(P＜0.05),且呈劑量依賴性(圖3)。

注:與CON 組相比,**P＜0.01;與MOD 組相比,##P＜0.01。

3 討論

AS 是一種累及動脈血管壁的慢性炎癥疾病,隨著生活水平和生活方式的改變,AS 呈現逐年上升趨勢,其發生發展與很多疾病緊密相關,比如肥胖病、高血壓、糖尿病及高膽固醇血癥等[11]。 目前他汀類藥物是預防和治療動脈粥樣硬化的常用藥物,但是他汀類藥物可能會出現肌痛、肌炎和橫紋肌溶解等肌肉病癥,嚴重情況下還可能引起急性腎衰竭和肝功能受損[12]。

淫羊藿來源于小檗科多年生草本植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥葉,其性溫而味辛、甘,歸肝、腎經,中醫臨床多用于腎陽虛衰,陽痿遺精,筋骨痿軟,風濕痹痛,麻木拘攣等癥。 淫羊藿具有悠久的藥用歷史,開始記載在《神農本草經》中。 現代的實驗研究發現,淫羊藿中含有多種化學成分,其中以黃酮類為主要化學成分,還包括酚苷類、多糖類、生物堿類等其他多種化學成分,淫羊藿具有多種藥理作用,比如抗炎、抗腫瘤、抗衰老和抗骨質疏松等[13]。 淫羊藿苷(ICA)是淫羊藿的主要活性成分之一,分子式為C33H40O15,分子量為676.65[14],是一種黃酮類的化合物,。 既往研究多集中于淫羊藿苷抗骨質疏松、抗炎、抗腫瘤和免疫調節等藥理作用方面,最近幾年來,越來越多的研究者們開始將研究目標轉移到ICA 對心血管系統的作用上,在ICA 抗AS、抗高血壓、抗心肌缺血等很多方面均取得了一些嶄新的科研成果。本課題組對ICA 具有較為系統和深刻的藥理學研究,目前成果主要集中在藥物安全性評價;對ApoE-/-小鼠的抗AS 作用及治療價值研究[15];對體外培養的平滑肌細胞藥理作用及機制研究[16]。 基于此,本研究以巨噬細胞為切入點,明確ICA 對巨噬細胞凋亡及炎癥因子的影響,從而揭示ICA 抗動脈粥樣硬化的作用。

巨噬細胞在AS 的形成、發生以及發展中發揮至關重要的作用,參與著全過程[17]。 巨噬細胞凋亡在AS 病變早期可以抑制AS 的發生進程,但是在病變晚期,巨噬細胞降解細胞內脂質的能力下降,巨噬細胞凋亡則導致不穩定斑塊的破裂,從而加速AS的發生進程[18]。 單核細胞遷移至內皮下分化形成巨噬細胞,巨噬細胞吞噬ox-LDL 形成泡沫細胞,泡沫細胞的形成是AS 發展過程中的一個典型事件[19]。 用ox-LDL 刺激巨噬細胞分化成泡沫細胞是研究AS 的經典模型,本研究在此模型上研究ICA的體外抗動脈粥樣硬化作用及其機制。 結果表明,加入不同濃度的ICA 處理24 h 后,經ox-LDL 誘導的巨噬細胞細胞活力增加,凋亡細胞數減少;細胞泡沫化減少;IL-1β、IL-6 和TNF-α 炎癥因子分泌減少,表明ICA 具有減少巨噬細胞凋亡并抑制IL-1β、IL-6 和TNF-α 炎癥因子分泌的作用,提示ICA 具有抗AS 的藥理作用。

在病理狀態下,細胞內源性凋亡通路會在巨噬細胞吞噬ox-LDL 的過程中被激活[20]。 Bcl-2 是定位在線粒體膜上的一種蛋白,與Bax 蛋白共同形成異源二聚體,從而來控制線粒體膜的通透性,防止細胞色素C 的流出而激活下游Caspase-3 凋亡蛋白引發內源性凋亡[21-22]。 當泡沫細胞出現生存障礙時,泡沫細胞會發生破裂,從而釋放出大量的炎癥因子和脂質吞噬物[23-24],進一步導致不穩定斑塊的形成和破裂。 劉學謙等[25]發現清心通脈飲可降低巨噬細胞的凋亡,其機制與降低促凋亡蛋白Bax 的表達,增加Bcl-2 蛋白表達有關;趙正等[26]研究發現TM 可引起Caspase-3 活性增加,誘導泡沫細胞凋亡,與ox-LDL 誘導的巨噬細胞泡沫化和凋亡結果相符;林徐澤等[27]研究表明脂肪因子Omentin-1 可顯著抑制巨噬細胞的凋亡,其機制與Omentin-1 促進巨噬細胞抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達,抑制Bax 及Caspase-3 的蛋白表達有關。 本研究結果表明,與CON 組相比,MOD 組Bax 和Caspase-3 蛋白表達增加,Bcl-2 蛋白表達減少;與MOD 組相比,ICA 將不同程度降低Bax 和Caspase-3 蛋白的表達,并提高Bcl-2 蛋白表達,并且呈劑量依賴性,與上述研究結果一致,表明ICA 可激活細胞內源性凋亡途徑引起細胞凋亡。

Park 等[28]研究發現, NF-κB 的激活能夠抑制巨噬細胞的凋亡,這一現象的發現提示可能與級聯放大炎癥反應相關。 NF-κB 的抑制因子是IκB,IκB與NF-κB 結合后,能夠阻止NF-κB 轉移到細胞核內。 當細胞處于靜息狀態時,NF-κB 和IκB 結合形成沒有活性的復合體,存在于胞漿中,當外界信號的刺激細胞后,IκB 激酶復合體則將IκB 磷酸化,使NF-κB 暴露出核定位的相關位點。 游離的NF-κB迅速進入到細胞核中,與特異性κB 序列結合,誘導基因轉錄,進而抑制巨噬細胞凋亡。 本研究中,MOD 組NF-κB p65 蛋白表達增加,IκBα 蛋白表達減少。 ICA 處理后發現:ICA 將不同程度地提高IκBα 蛋白表達,降低NF-κB p65 蛋白的表達,并且呈劑量依賴性,與以往人們研究結果一致,表明ICA能夠激活NF-κB 活性抑制巨噬細胞凋亡。 綜上所述,本研究在細胞水平證實了ICA 可以提高巨噬細胞活性并減少細胞凋亡,抑制相關炎癥因子的釋放,激活細胞內源性凋亡途徑和NF-κB 活性抑制凋亡蛋白的表達,為ICA 抗AS 的研究提供了實驗證據。