辣椒素通過上調(diào)MTSS1 表達抑制結腸癌細胞侵襲、遷移的實驗研究

黃 虹黃 蝶王瑞杰余壯明

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院介入血管外科,?？?570102;2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液透析科,?？?570102;3.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科,海口 570102;4.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科,海口 570102)

結腸癌作為消化道常見腫瘤,在中國其發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌,位于第3,早期癥狀不明顯,與腸炎等良性疾病易混淆,發(fā)現(xiàn)時已至晚期,且發(fā)病趨于年輕化,危害嚴重[1]。 目前治療結腸癌常見藥物為奧沙利鉑,但該藥物對血液、神經(jīng)系統(tǒng)會產(chǎn)生毒性,不能長期使用[2],因此,尋找安全有效且毒性副作用均低的藥物對于治療尤為重要。 辣椒素在臨床上應用有數(shù)十年,是辣椒中具有辛辣刺激性的復合物,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗肥胖、保護心臟等多項作用,且對腫瘤的作用越來越受到重視[3]。辣椒素作為潛在的新型治療藥物在人類癌癥中有一定應用,具有抗增殖、誘導細胞凋亡和自噬、抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移等作用[4]。 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子1(metastasis suppressor1,MTSS1)作為細胞間連接,參與肌動蛋白介導的細胞核形成與細胞間微絲分支穩(wěn)定性,可降低腫瘤的遷移、浸潤能力[5]。 在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn),辣椒素可以上調(diào)MTSS1、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases, MMP)-2、MMP-9,實現(xiàn)對腫瘤的抑制[6],但在結腸癌中尚無發(fā)現(xiàn)相關研究。 因此, 本文以人結腸癌細胞HCT116 作為研究對象,探討辣椒素對細胞侵襲、遷移的影響,并初步探討其機制,為臨床上辣椒素對結腸癌的治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞

人結腸癌細胞HCT116 購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫,目錄號:TCHu99。

1.2 主要試劑與儀器

辣椒素購自美國Sigma 公司,貨號:M1022-50M;引物由上海吉凱基因技術有限公司合成;LipofectamineTM2000 購自美國invitrogen 公司,貨號:11668019;CCK8 試劑盒購自廣州佳研生物科技有限公司,貨號:MA0218-15;結晶紫染色液購自上海碧云天公司,貨號:C0121;一抗辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)、MTSS1、MMP-2、MMP-9 購自英國abcam 公司,貨號分別為:ab6166、ab204127、ab92536、ab228402。 Transwell 小 室 購 自Costar 公司,型號:3460;全自動酶標儀購自美國Bio-Rad 公司,型號:Model 680;蛋白凝膠成像儀購自上海Tanon 公司,型號:Tanon2500。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

HCT116 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中,37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng),2 ～3 d 更換1 次培養(yǎng)液,細胞密度長至90%時傳代,細胞生長至對數(shù)期實驗。

1.3.2 siRNA 引物設計

Whitehead siRNA Selection Web Server 在線設計,MTSS1 siRNA:5’-GGTTCTGATTACAGCTGGT-3’、對照siRNA:5’-UACAGACCCCUCGAUCGGUTT-3’。

1.3.3 細胞分組

HCT116 細胞參考文獻[7]處理并進行預實驗。實驗1:10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組(10、25、50、100 μmol/L capsaicin group)分別加入終濃度為10、25、50、100 μmol/L 辣椒素,對照組(control group)不添加辣椒素,37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h;實驗2:對照組(control group)、100 μmol/L 辣椒素組(100 μmol/L capsaicin group)、100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA 組(100 μmol/L capsaicin+control siRNA group)、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組(100 μmol/L capsaicin+MTSS1 siRNA group),100 μmol/L

辣椒素組添加終濃度為100 μmol/L 辣椒素;100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組在100 μmol/L 辣椒素組的基礎上分別添加終濃度為50 nmol/L 對照siRNA、MTSS1 siRNA(參照LipofectamineTM2000 說明書轉(zhuǎn)染),轉(zhuǎn)染4 h 更換為終濃度為100 μmol/L 辣椒素培養(yǎng)液,對照組正常培養(yǎng)24 h。 CCK8 檢測細胞增殖情況;Transwell 檢測細胞侵襲情況;劃痕實驗檢測細胞遷移情況;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測細胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平。

1.3.4 CCK8 檢測細胞增殖情況

各組細胞在96 孔板中處理24 h,加入CCK8 繼續(xù)培養(yǎng)2 h,全自動酶標儀測定450 nm 波長下各孔吸光度(optical density,OD),增殖抑制率=(對照孔OD450-實驗孔OD450)/對照組OD450×100%,6 個重復孔。

1.3.5 Transwell 檢測細胞侵襲情況

各組細胞在24 孔板中處理24 h,收集細胞,無胎牛血清培養(yǎng)液稀釋成每毫升1×104個的單細胞懸液,Transwell 小室經(jīng)基質(zhì)膠上下包被后放入24 孔板中,小室下層加500 μL 完全培養(yǎng)液,上層加500 μL單細胞懸液,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,結晶紫染色后顯微鏡拍照并計數(shù)。1.3.6 劃痕實驗檢測細胞遷移情況

各組細胞在6 孔板中處理24 h,去培養(yǎng)液,PBS清洗細胞,劃痕后立即拍照,添加10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h 拍照,Image J 檢測細胞遷移情況。 遷移百分比=(0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積)/0 h 劃痕面積×100%。

1.3.7 Western blot 檢測細胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達情況

各組細胞在6 孔板中處理24 h,添加蛋白裂解液冰上裂解細胞10 min,10000 r/min 4℃離心20 min,上清為總蛋白,BCA 蛋白試劑盒測定總蛋白濃度。 每孔上樣20 μg,聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠、分離膠分離蛋白,NC 膜轉(zhuǎn)膜后,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加對應一抗TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9,4℃孵育過夜,洗滌后添加對應二抗常溫下孵育2 h。DAB 顯色試劑盒顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料以平均數(shù)±標準差( ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較行SNK-q檢驗,P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 辣椒素對細胞增殖的影響

與對照組相比,25、50、100 μmol/L 辣椒素組細胞增殖抑制率升高(P＜0.05)。 見表1。

2.2 辣椒素對細胞侵襲的影響

與對照組相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組細胞侵襲數(shù)量降低(P＜0.05)。 見表1、圖1。

圖1 不同濃度辣椒素處理細胞侵襲情況Figure 1 Invasion of cells at different concentrations of capsaicin concentrations of capsaicin

表1 不同濃度辣椒素處理細胞增殖抑制率、侵襲數(shù)量、遷移百分比的比較(n=6)Table 1 Comparison of cell proliferation inhibition rate, invasion number, and migration percentage at different

2.3 辣椒素對細胞遷移的影響

與對照組相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組細胞遷移百分比降低(P＜0.05)。 見表1、圖2。

圖2 不同濃度辣椒素處理細胞遷移情況Figure 2 Migration of cells at different concentrations of capsaicin

2.4 辣椒素對細胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平的影響

與對照組相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組細胞中TRPV1、MTSS1 蛋白水平升高,MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低(P＜0.05)。 見表2、圖3。

圖3 不同濃度辣椒素處理細胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平情況Figure 3 Protein levels of TRPV1, MTSS1, MMP-2 and MMP-9 in cells with different concentrations of capsaicin

表2 不同濃度辣椒素處理細胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比較(n=6)Table 2 Comparison of TRPV1, MTSS1, MMP-2 and MMP-9 protein levels in cells with different concentrations of capsaicin

2.5 干擾MTSS1 對辣椒素處理細胞侵襲的影響

與對照組相比,100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細胞侵襲數(shù)量降低(P＜0.05);分別與100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA 組相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA組細胞侵襲數(shù)量升高(P＜0.05)。 見圖4、表3。

圖4 干擾MTSS1 后辣椒素處理細胞侵襲的情況Figure 4 Invasion of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

2.6 干擾MTSS1 對辣椒素處理細胞遷移的影響

與對照組相比,100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細胞遷移百分比降低(P＜0.05);分別與100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA組相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細胞遷移百分比升高(P＜0.05)。 見圖5、表3。

表3 干擾MTSS1 后辣椒素處理細胞侵襲數(shù)量、遷移百分比的比較(n=6)Table 3 Comparison of the invasion and migration of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

圖5 干擾MTSS1 后辣椒素處理細胞遷移情況Figure 5 Migration of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

2.7 干擾MTSS1 對辣椒素處理細胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平的影響

與對照組相比,100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細胞中MTSS1 蛋白水平升高,MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低(P＜0.05);分別與100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對照siRNA 組相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA組細胞中MTSS1 蛋白水平降低,MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高(P＜0.05)。 見表4、圖6。

表4 干擾MTSS1 后辣椒素處理細胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比較(n=6)Table 4 Comparison of MTSS1, MMP-2 and MMP-9 protein levels in capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

圖6 干擾MTSS1 后辣椒素處理細胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平情況Figure 6 Protein levels of MTSS1, MMP-2 and MMP-9 in capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

3 討論

結腸癌細胞侵襲、遷移會造成遠處肺、骨、肝轉(zhuǎn)移,侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的最主要原因[8],因此,發(fā)現(xiàn)一種可以有效抑制結腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移且副作用小物質(zhì)對于結腸癌的治療意義重大。 辣椒素作為辣椒皮質(zhì)中生物堿,通過TRPV1 或其他途徑參與抗腫瘤作用,是抗腫瘤潛在藥物,具有廣闊應用前景[9-10],但作用機制復雜,目前具體機制尚不清楚,尚需進一步研究。 研究發(fā)現(xiàn),辣椒素可以抑制結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移,提示辣椒素對結腸癌具有抑制侵襲、遷移作用,實現(xiàn)對結腸癌的保護,但尚需研究機制。

辣椒素是唯一一種TRPV1 的天然激活劑,在結直腸的黏膜層、黏膜下層、肌肉層、肌肉神經(jīng)叢中均發(fā)現(xiàn)TRPV1 的表達,可調(diào)節(jié)腸道運動、分泌、循環(huán)等功能[11-12];在結腸癌中表達水平低于遠處正常組織,可能參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展[13]。 研究發(fā)現(xiàn),結腸癌細胞中添加辣椒素可以增加TRPV1 的蛋白水平,提示辣椒素激活TRPV1,實現(xiàn)對結腸癌的影響。 MTSS1 作為細胞骨架肌動蛋白銜接蛋白,作為支架蛋白參與板狀偽足形成過程,發(fā)揮腫瘤抑制作用[14],在正常組織中均有表達,但在結直腸癌、結腸癌中低表達甚至不表達,被認為是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制型基因[15-16]。 MMPs 幾乎可以降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白成分,可破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障,從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移[17];在眾多MMPs 中,MMP-2、MMP-9 參與血管基底膜降解過程,與腫瘤侵襲、遷移關系密切[18-19]。 進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達MTSS1 可以降低MMP-2、MMP-9 的表達,在膠質(zhì)瘤中MTSS1 調(diào)控MMP-2、MMP-9 發(fā)揮作用[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),添加辣椒素后可以促進MTSS1 的表達,從而降低MMP-2、MMP-9 蛋白表達,抑制結腸癌侵襲、遷移過程。 而添加MTSS1 抑制劑后,細胞侵襲、遷移過程增強,細胞中MMP-2、MMP-9 蛋白表達升高;MTSS1 抑制劑可以減弱辣椒素對細胞侵襲、遷移的抑制過程。 提示辣椒素通過促進MTSS1 表達,抑制MMP-2、MMP-9 蛋白表達,實現(xiàn)對侵襲、遷移的抑制。

綜上所述,辣椒素通過上調(diào)MTSS1 表達從而抑制結腸癌細胞侵襲、遷移過程,實現(xiàn)對結腸癌的保護,為臨床上結腸癌的治療提供一定參考依據(jù)。 但辣椒素不同濃度對腫瘤的影響差異極大,研究辣椒素治療結腸癌的最佳濃度是后續(xù)探究重點。