復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片對原發(fā)高血壓大鼠T 淋巴細胞亞群、早期腎損傷及AT1R/Smad3 蛋白作用機制研究

馮 靜張賢春

(海口市人民醫(yī)院,海口 570208)

原發(fā)性高血壓(spontaneous hypertension,EH)具有高致殘率、高死亡率,嚴重者會導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[1]。 原發(fā)性高血壓在臨床上主要表現(xiàn)為體循環(huán)動脈壓的增高,同時伴有器官功能或器質(zhì)性損害,嚴重的高血壓患者導(dǎo)致腦卒中等疾病的發(fā)生[2]。 目前,高血壓患者隨著社會生活節(jié)奏的加快而逐年增加,有數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),我國目前為止高血壓患者的患病率高達25%。 原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制相對復(fù)雜,目前尚沒有文獻明確的報道。 近些年研究顯示,血管的炎性反應(yīng)和內(nèi)皮損傷介導(dǎo)著高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。 還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在高血壓患者的血管壁內(nèi)有大量的炎癥反應(yīng),并且在高血壓的發(fā)生中這種炎癥反應(yīng)起主導(dǎo)作用[4]。 目前我國主要通過研究CD4+T 淋巴細胞亞群來反應(yīng)原發(fā)性高血壓的炎癥免疫反應(yīng),雖有很多的文獻報道,但CD4+T 淋巴細胞亞群在高血壓疾病中的作用機制還不是十分清楚。 血管緊張素Ⅱ會和它的受體之一zAng Ⅱ1 型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)相結(jié)合,進而讓血管發(fā)生收縮,釋放大量的醛固酮,增加細胞增生,這些不良效應(yīng)主要由AT1R 所介導(dǎo)[5]。 有文獻報道顯示,在高血壓患者的血清中發(fā)現(xiàn)了AT1R 抗體,因此推測機體的免疫功能介導(dǎo)高血壓疾病的發(fā)生[6]。 Smad(small mother against decapentapiegic)蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)信號通路中重要的細胞內(nèi)作用底物,其中Smad3 是其中的一種亞型[7]。 現(xiàn)有研究顯示,TGF/Smad 信號通路在心血管疾病中的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用,Smad 蛋白從基因轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[8],但AT1R、Smad3在高血壓中的表達還尚不清楚。 復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片是一種生物重要復(fù)方制劑,主要提取于天麻蜜環(huán)菌、黃芪和當(dāng)歸中,可以有效防止眩暈,且對舒筋活血有一定的效果,復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片不僅服用方便,不良反應(yīng)也相對較小[9-10]。 目前,還沒有復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片對高血壓作用的相關(guān)報道,本文旨在探究復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片對原發(fā)性高血壓大鼠T 淋巴細胞亞群、早期腎損傷及AT1R、Smad3 蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

大鼠購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[SCXK(浙)2017-0015],所有大鼠飼養(yǎng)在海南醫(yī)學(xué)院[SYXK(瓊)2019-0008]。 40 只SHR 大鼠,20 只Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,所有大鼠皆為SPF 級、雄性,8 周齡,體重180 ～200 g。 所有大鼠均飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動物房內(nèi),保證環(huán)境清潔,且室內(nèi)溫度保持在23℃～25℃,相對濕度保持在45%～50%,動物實驗過程經(jīng)海口市人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(20120LL077),本次實驗符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

山西康欣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片(批準文號: H14022944); 美國 Assay Biotechnology 公司生產(chǎn)的AT1R 抗體和Smad3 抗體;美國BD 公司生產(chǎn)的CD3+、CD4+、CD8+檢測試劑盒。 上海奧爾科技生物科技有限公司生產(chǎn)的大鼠無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng);日本奧林巴斯株式會社生產(chǎn)的BH2 型光學(xué)顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模

20 只WKY 大鼠作為正常組(NC 組)、40 只SHR 大鼠分為模型組(SHR 組)和藥物組(TMGT組),每組20 只。 將1 g 復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片用生理鹽水稀釋成3 mL 復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽溶液,TMGT組大鼠給予1 g/kg 天麻蜜環(huán)糖肽溶液灌胃干預(yù),每天3 次,連續(xù)干預(yù)8 周;NC 組大鼠和SHR 組大鼠均給予等量的生理鹽水灌胃干預(yù),每天3 次,連續(xù)干預(yù)8 周。

1.3.2 動物血壓測量

在給藥干預(yù)后0、2、4 和8 周時,分別測量NC組、SHR 組和TMGT 組大鼠的尾動脈收縮壓。 在測量時先把無創(chuàng)血壓檢測儀進行預(yù)熱,在大鼠的根部套上血壓計的充氣尾,在大鼠處于安靜狀態(tài)時,對大鼠的血壓進行測量,每組大鼠分別測量3 次,取平均值。

1.3.3 流式細胞儀檢測外周血T 淋巴細胞亞群

分別麻醉NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠,采集大鼠腹主動脈血液3 mL,離心處理后,棄掉上清液,將PBS 溶液加入其中進行稀釋,充分混勻后,在淋巴細胞分離液上鋪滿液體,離心后把中間的白層膜部分取出,再次離心后,把上清液棄掉,重懸細胞制備成淋巴細胞懸液。 將懸液放置在測定管中,分別設(shè)為空白管和對照管,在管中加入CD3+、CD4+、CD8+熒光抗體,輕搖測定管混勻,在室溫環(huán)境中孵育,20 min 后再次用PBS 溶液重懸,最后對T 淋巴細胞亞群進行檢測。

1.3.4 ELISA 檢測血清中IL-6、TNF-α 的含量

分別取NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠的腹主動脈血,2000 r/min 的速度離心5 min,取出離心后的上清液,分別測量各組大鼠血清中IL-6、TNF-α 的含量。

1.3.5 腎組織病理學(xué)觀察

采用HE 染色和PAS 染色切片法,處死3 組大鼠后取出腎組織,將制備好的切片組織放置在圖像分析儀上,分別觀察NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠腎組織的病理變化。

1.3.6 Western blot 檢測腎組織中AT1R、Smad3 蛋白表達

分別取NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠50 mg腎組織,用Western blot 裂解液裂解后用玻璃均漿器在冰上對組織進行研磨,30 min 后以12000 r/min的速度離心5 min,取上清液,蛋白濃度用BCA 法進行檢測,在每孔中加入50 μg 蛋白樣品,根據(jù)蛋白濃度計算樣本體積。 把濃縮的SDS-PAGE 緩沖液加入到上清液中,加熱上清液,5 min 后在預(yù)制的膠孔中把蛋白樣本加入,在封閉的環(huán)境中孵育。 1 h 后加入一抗,TBST 溶液將蛋白樣品清洗3 次,凝膠成像系統(tǒng)曝光成像,進一步分析。

1.3.7 RT-PCR 檢測Smad3 和AT1R 蛋白表達

分別取NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠50 mg腎組織,用TRIzol 裂解液將組織裂解,而后提取組織中總的RNA。 分別檢測腎組織中AT1R、Smad3 mRNA 的表達。 引物序列:AT1R 上游引物:5’-GAGAGGATTCGTGGCTTGAG-3’, 下 游 引 物: 5’-TAAGTCAGCCAAGGCGAGAT-3’;Smad3 上游引物:5’-CCTGGCTACCTGAGTGAAGATG-3’,下游引物:5’-AGTAGGAGATGGAGCACCAAAAC-3’。 擴 增 條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃預(yù)變性15 s;60℃退火1 min,共計40 個循環(huán)。 AT1R、Smad3 mRNA 相對表達量用2-△△Ct法進行計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.1 軟件對NC 組、PT 組和miR-223 組的數(shù)據(jù)進行分析。 用平均數(shù)±標準差( ˉx±s)的形式表示3 組間的數(shù)據(jù),3 組間的數(shù)據(jù)比較用單因素方差法進行檢驗,兩組間比較采用LSD-t進行檢驗;以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尾動脈收縮壓測量比較

和NC 組大鼠相比,SHR 組和TMGT 組大鼠給藥后0 周尾動脈收縮壓均明顯升高(P＜0.05),但給藥后0 周SHR 組和TMGT 組大鼠尾動脈收縮壓沒有明顯的變化(P＞0.05)。 和NC 組相比,SHR 組在給藥后2、4 和8 周時大鼠尾動脈收縮壓顯著升高(P＜0.05);和SHR 組給藥后2、4 和8 周時大鼠尾動脈收縮壓相比,TMGT 組大鼠均得到顯著抑制(P＜0.05),見表1。

表1 各組大鼠不同時間尾動脈收縮壓測量比較(ˉx±s,n=20)Table 1 Comparison of tail artery systolic blood pressure in different groups at different time

2.2 各組大鼠外周血CD4+和CD8+細胞表達頻率及CD4+/CD8+比值

NC 組大鼠外周血CD4+細胞表達頻率為(63.21±2.13),CD8+細胞表達頻率為(34.21±1.65);SHR 組大鼠外周血CD4+(81.15±2.62)細胞表達頻率較NC組顯著升高(P＜0.05),CD8+(25.33±1.96)細胞表達頻率較NC 組顯著降低(P＜0.05);干預(yù)后的TMGT 組大鼠外周血CD4+(66.73±1.57)細胞表達頻率較SHR組顯著降低,CD8+(32.76±2.35)細胞表達頻率較SHR 組顯著升高(P＜0.05)。 和NC 組大鼠CD4+/CD8+比值(1.62±0.15)相比較,SHR 組大鼠CD4+/CD8+比值(2.26±0.31)顯著升高(P＜0.05);干預(yù)后的TMGT 組大鼠的CD4+/CD8+比值(1.85±0.12)較SHR 組顯著降低(P＜0.05),見圖1 和圖2。

圖1 流式細胞儀檢測各組大鼠外周血CD4+和CD8+細胞表達頻率及CD4+/CD8+比值Figure 1 Expression frequency of CD4+and CD8+cells and the ratio of CD4+/CD8+in peripheral blood of rats in each group were detected by flow cytometry

注:與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

2.3 血清中IL-6、TNF-α 含量比較

和NC 組大鼠血清中炎癥因子IL-6 和TNF-α含量相比較,SHR 組大鼠顯著升高(P＜0.05);和SHR 組相比,TMGT 組大鼠血清中IL-6 和TNF-α 含量顯著降低(P＜0.05),見表2 和圖3。

注:與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量比較(ˉx±s,n=20)Table 2 Comparison of IL-6 and TNF-α in serum of rats in each group

2. 4 三組大鼠腎組織病理學(xué)變化比較

和NC 組大鼠腎組織比,SHR 組大鼠腎小球明顯增大,基底膜增厚且腎小球出現(xiàn)大量的空炮,毛細血管明顯狹窄,且出現(xiàn)閉塞;和SHR 組大鼠腎組織比,TMGT 組腎組織得到了明顯的改善,見圖4。

注:A:大鼠腎組織HE 染色;B:大鼠腎組織PAS 染色。

2.5 各組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白表達比較

和NC 組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白表達相比較,SHR 組均顯著增加(P＜0.05);和SHR 組相比,TMGT 組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白表達均顯著降低(P＜0.05),見圖5。

注:A:3 組大鼠腎組織中Smad3 蛋白和AT1R 蛋白表達;B:3 組大鼠腎組織中Smad3 蛋白和AT1R 蛋白表達比較。 與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

2.6 各組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R mRNA表達比較

NC 組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R mRNA 分別為(1.01±0.10)和(0.27±0.02);SHR 組大鼠腎組織中Smad3 mRNA(3.27±1.21)和AT1R mRNA(0.89±0.05)較NC 組均顯著增加(P＜0.05);和SHR 組相比,TMGT 組大鼠腎組織中Smad3 mRNA(1.58±0.23)和AT1R mRNA(0.34±0.03)顯著降低(P＜0.05),見圖6。

注:與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

3 討論

高血壓是一種慢性的炎癥反應(yīng),其發(fā)病機制和很多因素都有密切關(guān)系,例如遺傳基因、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活、胰島素抵抗及血管內(nèi)皮功能受損等,以上因素均可導(dǎo)致機體的免疫功能發(fā)生紊亂[11]。 研究發(fā)現(xiàn),免疫功能在高血壓疾病中起主導(dǎo)作用,高血壓發(fā)生時,在血管周圍常發(fā)現(xiàn)大量的炎癥反應(yīng),在機體中炎癥免疫發(fā)生作用,增加趨化因子的表達,升高黏附因子的含量,同時增加超氧化物的釋放,從而加強機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。炎癥免疫系統(tǒng)會降低血管的舒張功能,召集大量的內(nèi)皮細胞,包括T 淋巴細胞等,增加內(nèi)皮細胞的數(shù)量且增強細胞的粘附性,進而升高血壓[13]。 文獻顯示,炎癥免疫失調(diào)介導(dǎo)著高血壓的發(fā)生發(fā)展,高血壓的患病率會隨著炎癥因子的增加而增加[14]。 可見,免疫炎癥反應(yīng)參與者高血壓的發(fā)生、發(fā)展。 天麻為蘭科植物,其干燥塊莖為常用名貴中藥,其具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值。 蜜環(huán)菌隸屬于擔(dān)子菌亞門傘菌目白磨科蜜環(huán)菌屬。 蜜環(huán)菌是天麻生長發(fā)育的基礎(chǔ),為天麻的生長發(fā)育提供養(yǎng)分。 有研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片可提高外周動脈血管的順應(yīng)性,讓大腦的血量得到增加,與此同時也加強了中央血管的順應(yīng)性,進而達到降低血壓的效果[15]。 本實驗結(jié)果顯示,SHR 組大鼠尾靜脈收縮壓較NC 組顯著升高,在復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片干預(yù)后大鼠的動脈收縮壓得到明顯抑制,提示復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片可有效改善高血壓大鼠血管的舒縮功能,進而實現(xiàn)降壓的目的。

T 淋巴細胞參與著高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展,在高血壓發(fā)生時,活化的T 淋巴細胞向腎及外周血管遷移,可見調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和高血壓的發(fā)生密切相關(guān)。 本研究發(fā)現(xiàn),SHR 組大鼠外周血CD4+/CD8+淋巴細胞的比值較NC 組明顯升高,說明機體內(nèi)的T淋巴細胞數(shù)量發(fā)生異常變化,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失衡,讓機體處于免疫抑制狀態(tài)。 經(jīng)過復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片干預(yù)后大鼠的CD4+/CD8+淋巴細胞比值得到明顯抑制,可見復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片對高血壓大鼠的T 淋巴細胞的數(shù)量進行調(diào)節(jié),改善機體的免疫系統(tǒng),進而調(diào)節(jié)機體的血壓處于正常狀態(tài)。 張小娟等[16]通過對高血壓患者臨床研究證實,給予復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片的觀察組患者的治療效果明顯好于給予非洛地平緩釋片聯(lián)合纈沙坦的對照組患者,以復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片對輔助治療高血壓的效果顯著。 近些年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)和高血壓有關(guān)的炎癥標記物有IL-6、TNF-α 等,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SHR 組大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量顯著高于NC 組,復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片干預(yù)后高血壓患者血清中炎癥因子IL-6、TNF-α 含量均得到明顯抑制,可見復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片在高血壓發(fā)生中有效調(diào)控IL-6、TNF-α促炎因子,進而發(fā)揮良好的抗炎效果。 丁東新等[17]研究發(fā)現(xiàn),老年原發(fā)性高血壓患者血清中有大量炎癥因子IL-6、TNF-α 標記物,且炎癥標記物和血壓的嚴重程度成正相關(guān)。

血管緊張素Ⅱ是RAS 最重要的血管活性物質(zhì),主要通過AT1R、AT2R 來實現(xiàn)多種生理調(diào)節(jié)作用。血管緊張素Ⅱ通過AT1R 在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著收縮血管、調(diào)節(jié)血壓和水鈉平衡等作用,而通過AT2R 受體調(diào)節(jié)擴血管的同時抑制腎小球旁細胞腎素合成[18]。 Smad 可分為Smad1 ～Smad8,其中Smad3 對受體有一定的調(diào)節(jié)作用。 有研究發(fā)現(xiàn),激活smad 蛋白可通過轉(zhuǎn)錄抑制PPAY-γ 的表達,降低PPAY-γ對血管的保護作用,進而加重肺動脈高壓的發(fā)生。本研究顯示,SHR 組大鼠組織中Smad3 和AT1R 蛋白及相對表達量均高于NC 組大鼠,Smad3 升高說明高血壓大鼠腎受損,給予復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片干預(yù)后高血壓大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白及相對表達量得到明顯抑制,提示復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片可抑制Smad3 和AT1R 蛋白表達,進而延緩高血壓性腎病的進程。 伊林等[19]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸可能通過其有效成分藁苯內(nèi)酯對血壓有干預(yù)作用,可能通過AT1R 靶點發(fā)揮作用。 李攆萍[20]研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片聯(lián)合硝苯地平對高血壓患者起有效的治療效果,并且無嚴重的不良反應(yīng)發(fā)生,值得臨床使用。

綜上所述,復(fù)方天麻蜜環(huán)糖肽片可有效調(diào)節(jié)高血壓大鼠T 淋巴細胞亞群,改善機體的免疫功能,緩解高血壓導(dǎo)致的早期腎損傷,同時抑制腎組織中的Smad3 和AT1R 蛋白表達,進而對高血壓疾病進行治療。