ORMDL3 通過內質網應激介導的細胞自噬在中性粒細胞哮喘中的作用機制研究

王龍梅孫永顯張新鵑陳曉艷

(山東中醫藥高等專科學校,西醫教學部,山東 煙臺 264199)

支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的氣道炎癥性疾病,過去的研究認為嗜酸性粒細胞浸潤是哮喘發病過程中氣道炎癥反應的主要原因,近些年的研究認為超過50%的哮喘以中性粒細胞浸潤為主,中性粒細胞哮喘的臨床表現及肺功能均較嗜酸性粒細胞哮喘更差[1-2],但關于中性粒細胞哮喘的發病機制尚不十分清楚。 有研究報道,在哮喘發病過程中,氣道內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及細胞自噬均過度激活,ERS 介導細胞自噬激活、自噬標志基因Beclin-1 表達增加且LC3-I向LC3-II 轉化,可能引起氣道上皮損傷、增加氣道反應性[3-4]。

ORMDL3 ( ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3)基因是新發現的哮喘易感基因,定位于17q21 染色體區,主要的生物學功能包括調控ERS及細胞自噬等[5-6]。 ERS 相關的信號通路包括蛋白激酶R 樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK ) 通 路、 肌 醇 酶 1 ( inositolrequiringenzyme1,IRE1) 通 路、 活 化 轉 錄 因 子6(activating transcription factor,ATF6) 通 路, 其 中ORMDL3 重要通過ATF6 通路實現對ERS 的調控。但ORMDL3 在中性粒細胞哮喘發病中的作用是否與ERS 介導的細胞自噬有關尚不明確。 因此,本研究將通過一系列動物實驗來闡明ORMDL3 通過ERS 介導的細胞自噬在中性粒細胞哮喘發病中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物公司[SCXK(滬)2018-0006],共72 只,SPF 級,8 ～10 周齡,體重180 ～200 g。 飼養單位為山東中醫藥高等專科學校[SYXK(魯)2019-0051]。 動物實驗獲得山東中醫藥高等專科學校倫理委員會批準(ktyd-2019-023),實驗過程遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖(LPS,批號L2880)、卵白蛋白(OVA,批號A5253)(Sigma 公司,美國);ORMDL3-siRNA 慢病毒、陰性對照(negative control,NC)-siRNA 慢病毒(吉凱公司,上海),滴度均為1×109TU/mL;ERS 激動劑毒胡蘿卜素(批號HY-13433,MCE 公司,美國); ORMDL3 (批 號 ab211522)、 PERK (批 號ab229912)、IRE1α(批號ab37073)、ATF6 (批號ab122897)、Beclin-1(批號ab207612)、LC3(批號ab192890)一抗(Abcam 公司,美國)。

小動物肺功能儀(新行興業科貿公司,北京);正置顯微鏡(Nikon 公司,日本);凝膠電泳系統(Bio-rad 公司,美國);凝膠成像系統(勤翔公司,上海)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及干預

動物實驗分為兩部分,第1 部分研究ORMDL3在中性粒細胞哮喘中的作用,實驗動物隨機分為對照組、模型組、模型+NC-siRNA 組、模型+ORMDL3-siRNA 組,后3 組進行中性粒細胞哮喘模型制備:第1、7、14 天時給予0.1 μg LPS 滴鼻、100 μg OVA 腹腔注射,第15 天起給予10 g/L OVA 霧化吸入激發、每天1 次、每次30 min、連續14 d。 模型+NC-siRNA組、模型+ORMDL3-siRNA 組在第15 天、即OVA 激發前進行干預, 分別給予NC-siRNA 慢病毒、ORMDL3-siRNA 慢病毒50 μL 經氣道注入。

第2 部分研究ERS 在ORMDL3 參與中性粒細胞哮喘中的作用,實驗動物隨機分為溶劑對照組、模型+溶劑組、模型+NC-siRNA+溶劑組、模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組、模型+ORMDL3-siRNA+激動劑組,造模方法和慢病毒注射方法同第1 部分,模型+ORMDL3-siRNA+激動劑組第15 天起,給予300 ng/kg 毒胡蘿卜素腹腔注射、每天1 次,其余各組給予等劑量溶劑腹腔注射、每天1 次。

1.3.2 氣道功能檢測

末次激發后24 h,采用小動物肺功能儀連接,測定0.2 s 用力呼氣容積(FEV0.2)占用力肺活量(FVC) 的比值,FEV0.2/FVC 以及呼氣峰流速(PEF)。

1.3.3 肺組織病理改變檢測

完成氣道功能檢測后,處死大鼠并收集適量肺組織,生理鹽水清洗后4%多聚甲醛固定,制作病理切片后采用HE 染色試劑盒進行實驗,按照試劑盒說明書進行染色并在顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.3.4 蛋白表達水平檢測

另取適量肺組織,采用組織裂解液進行勻漿、提取組織蛋白,檢測蛋白濃度并取30 μg 蛋白進行實驗,將蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳分離不同分子量的蛋白后電轉移至NC 膜,4℃孵育1 ∶ 1000 稀釋的ORMDL3、PERK、IRE1α、ATF6、Beclin-1、LC3 一抗或1 ∶2500 稀釋的β-actin 一抗16 ～24 h,室溫孵育1 ∶2000 稀釋的二抗1 h,最后在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶,根據條帶吸光值、 以 β-actin 為 內 參, 計 算 ORMDL3、 PERK、IRE1α、ATF6、Beclin-1、LC3 的表達水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件及Prism 6.0 進行統計學分析及制圖,實驗數據均為計量資料,經正態性檢驗符合正態分布,采用平均數±標準差(ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,有統計學差異的資料進一步采用LSD-t法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中性粒細胞哮喘模型大鼠肺組織中ORMDL3表達的變化及注射慢病毒敲低ORMDL3 的效果

模型組大鼠肺組織中ORMDL3 的表達水平較對照組升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組肺組織中ORMDL3 的表達水平較模型組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA 組肺組織中ORMDL3的表達水平較模型+NC-siRNA 組降低(P＜0.05)。見圖1。

注:與對照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.2 敲低ORMDL3 對中性粒細胞哮喘模型大鼠氣道功能的影響

模型組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較對照組降低(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較模型組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA 組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水 平 較 模 型+NC-siRNA 組 升 高(P＜0.05)。 見圖2。

注:與對照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.3 敲低ORMDL3 對中性粒細胞哮喘模型大鼠肺組織病理改變的影響

對照組肺組織結構正常、未出現病理改變;模型組、模型+NC-siRNA 組均出現炎癥細胞浸潤,支氣管管壁及平滑肌、基底膜增厚,管腔變窄等病理改變;模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+NC-siRNA+溶劑組改善;模型+ORMDL3-siRNA+激動劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組加重。 見圖3。

圖3 4 組大鼠肺組織病理改變的比較(HE 染色)Figure 3 Comparison of pathological changes of lung tissue among four groups (HE staining)

2.4 敲低ORMDL3 對中性粒細胞哮喘模型大鼠肺組織中ERS 標志基因表達的影響

模型組大鼠肺組織中PERK、IRE1α、ATF6的表達水平較對照組升高(P＜0. 05),模型+NCsiRNA 組肺組織中PERK、IRE1α、ATF6 的表達水平較模型組無明顯變化(P＞0. 05),模型+ORMDL3-siRNA 組肺組織中ATF6 的表達水平較模型+NC-siRNA 組 降 低(P＜0. 05)、PERK 及IRE1α 的表達水平較模型+NC-siRNA 組無明顯變化(P＞0. 05)。 見圖4。

注:與對照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.5 敲低ORMDL3 對中性粒細胞哮喘模型大鼠肺組織中自噬標志基因表達的影響

模型組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達水平較對照組升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA組肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達水平較模型組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA組肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達水平較模型+NC-siRNA 組降低(P＜0.05)。 見圖5。

注:與對照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.6 ERS 激動劑對敲低ORMDL3 改善中性粒細胞哮喘模型大鼠氣道功能的影響

模型+溶劑組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較溶劑對照組降低(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組+溶劑組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較模型+溶劑組無變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較模型+NC-siRNA 組+溶劑組升高(P＜0.05),模型+ORMDL3-siRNA+激動劑組大鼠的FEV0.2/FVC、 PEF 水平較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組降低(P＜0.05)。 見圖6。

注:與溶劑對照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA+溶劑組相比,#P＜0.05;與模型+ ORMDL3-siRNA+溶劑組相比,＆P＜0.05。

2.7 ERS 抑制劑對敲低ORMDL3 改善中性粒細胞哮喘模型大鼠肺組織病理改變的影響

溶劑對照組肺組織結構正常、未出現病理改變;模型+溶劑組、模型+NC-siRNA 組+溶劑組均出現炎癥細胞浸潤,支氣管管壁及平滑肌、基底膜增厚,管腔變窄等病理改變;模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+NC-siRNA 組+溶劑組改善;模型+ORMDL3-siRNA+激動劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組加重。 見圖7。

圖7 5 組大鼠肺組織病理改變的比較(HE 染色)Figure 7 Comparison of pathological changes of lung tissue among five groups (HE staining)

2.8 ERS 抑制劑對敲低ORMDL3 抑制中性粒細胞哮喘模型小鼠肺組織自噬的影響

模型+溶劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達水平較溶劑對照組升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組+溶劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達水平較模型+溶劑組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達水平較模型+NC-siRNA 組+ 溶劑組降低(P＜0.05),模型+ORMDL3-siRNA+激動劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達水平較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組升高(P＜0.05)。 見圖8。

注:與溶劑對照組比較,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA+溶劑組比較,#P＜0.05;與模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組比較,＆P＜0.05。

3 討論

中性粒細胞哮喘是哮喘的獨立亞型,臨床癥狀重、激素治療反應差且機制未完全闡明。 ORMDL3基因屬于ORM 家族、定位于17q21 染色體區,是哮喘易感基因;該家族另兩個成員分別是ORMDL1 及ORMDL2,分別定位于2q32 和12q13.2 染色體區,未見其與哮喘相關的報道。 本研究采用LPS+OVA致敏、OVA 激發的方式建立了中性粒細胞哮喘模型,模型大鼠出現了哮喘典型的氣流受限、肺組織病理改變,且肺組織中ORMDL3 表達增加,表明中性粒細胞哮喘模型制備成功且ORMDL3 高表達與中性粒細胞哮喘的發病有關。 進一步在OVA 激發誘導哮喘前通過注射ORMDL3-siRNA 慢病毒的方式敲低ORMDL3 的表達,結果發現敲低ORMDL3 的表達能夠改善哮喘大鼠的氣道功能及肺組織病理改變,表明ORMDL3 表達增加與中性粒細胞哮喘的發病有關。

ORMDL3 具有多樣的生物學功能,有研究報道ORMDL3 在脾細胞[7]、β 細胞[8]、白細胞[9]中參與ERS 的調控。 ERS 是一種病理刺激下未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網聚集引發的未折疊蛋白反應,由PERK、 IRE1α、 ATF6 進 行 信 號 轉 導, 其 中ORMDL3 主要通過ATF6 通路激活ERS。 已有研究報道,在哮喘發病過程中存在ERS 過度激活[10-12],本研究也證實模型大鼠肺組織中3 種ERS 標志基因的表達水平均明顯增加,與既往文獻關于ERS 與哮喘的報道一致[10-12]。 在注射慢病毒敲低ORMDL3 后,哮喘大鼠肺組織ATF6 的表達水平降低,而PERK、IRE1α 的表達水平無明顯變化,表明ORMDL3 參與ERS 中ATF6 通路的調控,高表達的ORMDL3 可能通過激活ERS 的ATF6 通路參與哮喘發病,阻斷ORMDL3 抑制哮喘發病過程中ERS 的ATF6 通路并起到治療作用。

ERS 在哮喘發病過程中的作用復雜,心腦血管相關的研究證實ERS 是自噬的上游調控機制[13-14]。自噬是細胞內各種基質及細胞器通過溶酶體系統發生降解的過程,適度自噬有利于細胞在壓力環境下存活,但過度激活的自噬會引起細胞損傷。 在哮喘發病過程中自噬過度激活,使用自噬抑制劑能夠改善哮喘大鼠的氣道功能[15-16]。 本研究在模型大鼠肺組織中檢測到自噬標志基因Beclin-1 及LC3-II/LC3-I 的表達水平增加,敲低ORMDL3 后Beclin-1及LC3-II/LC3-I 的表達水平降低,表明高表達的ORMDL3 在哮喘發病過程中參與自噬的激活。 為了進一步闡明ERS 介導的細胞自噬在ORMDL3 參與中性粒細胞哮喘中的作用,本研究在敲低ORMDL3 后給予ERS 激動劑毒胡蘿卜素干預,通過毒胡蘿卜素激活ERS 后,敲低ORMDL3 改善氣道功能、肺組織病理改變及抑制細胞自噬的作用發生逆轉,表明ORMDL3 參與中性粒細胞哮喘的作用與ERS 介導的細胞自噬有關,阻斷ORMDL3 抑制哮喘發病過程中ERS 介導的細胞自噬并起到治療作用。

綜上所述,在中性粒細胞哮喘的發病中,ORMDL3 參與ERS 及細胞自噬的調控,高表達的ORMDL3 通過ERS 的ATF6 通路激活細胞自噬,進而引起氣流受限、肺組織病理改變。 將來;阻斷ORMDL3 通過抑制ERS ATF6 通路介導的細胞自噬改善氣流受限、肺組織病理改變,有望成為治療中性粒細胞哮喘的可能靶點。