卡托普利對(duì)SHR 大鼠eNOS、iNOS 表達(dá)的影響

蔣嘉燁栗 源可 燕

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,上海 201203; 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心,上海 201203)

高血壓可引起左室肥厚,同時(shí),導(dǎo)致引起血管內(nèi)皮功能障礙[1]。 通常認(rèn)為一氧化氮(NO)低濃度時(shí)主要發(fā)揮生理作用,而NO 高濃度時(shí)參與許多病理過(guò)程,大量研究顯示,NO 與高血壓密切相關(guān)。 在各種臨床和實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道顯示隨著高血壓的發(fā)生發(fā)展,體內(nèi)產(chǎn)生NO 量的多少存在一定的爭(zhēng)議,血壓升高導(dǎo)致NO 減少、不變或增加都有報(bào)道[2-4]。

NO 的產(chǎn)生主要由一氧化氮合成酶(NOS)催化L-精氨酸與氧分子通過(guò)氧化還原反應(yīng)生成。 由于NOS 是體內(nèi)生成NO 的唯一限速酶,它催化L-精氨酸生成NO。 在迄今為止發(fā)現(xiàn)的NOS 的3 種亞型中,神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在生理情況下表達(dá)發(fā)揮生理功能,只有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在病理狀態(tài)下表達(dá)[5]。 NO 影響高血壓的發(fā)生、發(fā)展,但是NO 半衰期極短,不容易檢測(cè),因此往往只能通過(guò)檢測(cè)一氧化氮合酶(NOS)來(lái)間接研究NO 的作用。 已有報(bào)道表明隨著年齡的增長(zhǎng),自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)存在一氧化氮合酶的過(guò)度表達(dá)[6-7],但SHR 隨年齡增加,心臟與動(dòng)脈iNOS 和eNOS 的動(dòng)態(tài)變化及不同時(shí)期參與NO 生成的具體NOS 并未有系統(tǒng)的研究報(bào)道。

本研究中以SHR 為模型,研究其隨著年齡增大,心臟與動(dòng)脈iNOS 和eNOS 的變化情況,并應(yīng)用卡托普利干預(yù),考察藥物對(duì)SHR 模型一氧化氮合酶-一氧化氮系統(tǒng)的影響,探討SHR 不同時(shí)期iNOS 和eNOS 在心臟與動(dòng)脈中可能參與NO 生成的機(jī)制及卡托普利對(duì)左室肥厚和血管內(nèi)皮功能改善的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康6 周齡雄性SPF 級(jí)Wistar-Kyoto 大鼠(WKY)(24 只)和SHR(42 只),體重150～180 g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2017-0005],所有動(dòng)物在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK(滬)2020-0009],室溫(22±1)℃,12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán),自由獲取食物和水。 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后入組,進(jìn)行相應(yīng)的操作。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,在3R 原則的指導(dǎo)下給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷,并參照上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定有序進(jìn)行(P2SHUTCM210129001),實(shí)驗(yàn)遵守3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

卡托普利由中美上海施貴寶制藥有限公司提供(批號(hào): 0809031); TRIzol (美國(guó) Invitrogen);RealMasterMix(天根生化科技有限公司);BioDev RT-PCR kit(立陶宛MBI);Rotor-6000 熒光定量PCR 儀(基因有限公司)。 PCR 擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra); D-78532 高速冷凍離心機(jī)( 德國(guó)Hettich);超低溫冰箱(美國(guó)Thermo);全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices);Griess 試劑盒(美國(guó)Promega);BP-600A 全自動(dòng)大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(成都泰盟有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理

6 周齡雄性WKY(24 只)和SHR(42 只),6 周齡時(shí)分別處理WKY 和SHR 各6 只,剩余18 只WKY 大鼠和36 只SHR。 將其余SHR 大鼠分為兩組:卡托普利對(duì)照組和高血壓模型(SHR)組,每組18 只大鼠。 對(duì)照組灌服卡托普利(3.375 g/(kg·d)),SHR 組和WKY 組給予等量的蒸餾水。 灌胃至24 周齡結(jié)束,后停藥繼續(xù)觀察至32 周齡。 各組在18、24 和32 周齡時(shí)各處理1 批(n=6)。

1.3.2 血壓

實(shí)驗(yàn)期間,每?jī)芍軣o(wú)創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠血壓變化,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使大鼠處于熟悉環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)作輕柔,減少大鼠應(yīng)激反應(yīng),每只大鼠測(cè)3 次,取其平均值,減少實(shí)驗(yàn)誤差。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)定專人規(guī)范化定時(shí)測(cè)定,減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.3.3 左心室質(zhì)量指數(shù)

各組大鼠取血完畢后,將心臟取出,并沿房室間溝及室間隔剪去主、肺動(dòng)脈血管,大靜脈,兩心房及右心室,保留室間隔,用0.9%生理鹽水沖洗,用吸水紙吸干水分,稱量左心室重量(左心室+室間隔重量)并計(jì)算其與體重的比值作為左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。

所有WKY 和SHR 大鼠處死后,分離胸主動(dòng)脈放置于Krebs-Henseleit 緩沖液(K-H 液)中,剔除血管周圍脂肪后,將胸主動(dòng)脈剪成3 mm 左右的血管環(huán)。 挑選長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)膬蓷l分別置于5 mL 體積37℃恒溫浴槽內(nèi),槽內(nèi)一直通入含有95% O2和5% CO2的混合氣體。 血管環(huán)一端固定于槽底,另一端連接張力換能器,胸主動(dòng)脈每條血管環(huán)給予2.0 g 拉力,20 min 換液1 次平衡3 次共計(jì)60 min。 60 mmol/L的KCl 預(yù)收縮兩次后加入10-6mol/L 濃度的PE 收縮,待血管拉力達(dá)到坪值后,加入梯度濃度的乙酰膽堿(acetylcholine, Ach)(10-9、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L),觀察血管隨Ach 加入的舒張情況。 以FSK 10-6mol/L 的舒張程度作為100%舒張度,根據(jù)10-5mol/L 濃度Ach 的舒張度判斷內(nèi)皮完整性[7]。1.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)

取約100 mg 大鼠心肌組織,加入1 mL TRIzol試劑,按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA 提取,所用RNA 的A260/A280需再在1.8～2.0 之間。 逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,分別由iNOS、eNOS 和GAPDH 引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。 引物序列分別為,iNOS 上游引物:5’-ATCCCGAAACGCTACACTT-3’, 下 游 引 物: 5’-CGGCTGGACTTCTCACTC-3’。 eNOS 上游引物:5’-CCGGCGCTACGAAGAATG-3’, 下 游 引 物: 5’-CAGTGCCACGGATGGAAATT-3’。 GAPDH 上游引物:5’-CAGAACATCATCCCTGCATC-3’,下游引物:5’-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’。 RT 反應(yīng)條件為42℃,2 h;95℃,5 min。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性15 min,1 個(gè)循環(huán);95℃15 s,60℃20 s,72℃30 s,40 個(gè)循環(huán),繪制熔解曲線。 結(jié)果由熒光定量分析儀自動(dòng)采集給出目的基因和對(duì)照基因的Ct 值,參照文獻(xiàn)將Ct 值轉(zhuǎn)化為相對(duì)倍數(shù),基因表達(dá)量采用實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組=2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算,其中△△Ct=(Ct 目的-Ct 對(duì)照)實(shí)驗(yàn)-(Ct 目的-Ct 對(duì)照)對(duì)照。 心肌和動(dòng)脈eNOS 和iNOS mRNA 表達(dá)之間的 倍 數(shù) 按2-△Ct進(jìn) 行 計(jì) 算, 即 為(2-△Ct)eNOS/(2-△Ct)iNOS,其中△Ct=Ct 目的-Ct 對(duì)照。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)

采用提取大鼠心肌組織的總蛋白,BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠,樣品加熱變性后每孔上樣80 μg。 電泳在濃縮膠中時(shí)使用80 V電壓,到分離膠以后使用120 V,電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。 采用濕式電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上,4℃下恒流400 mA 轉(zhuǎn)膜1.5 h。5%脫脂奶粉TBST 緩沖液室溫封閉1 h。 一抗iNOS(1 ∶200)、GAPDH (1 ∶5000)4℃孵育過(guò)夜。 TBST洗膜,分別加入抗兔二抗(1 ∶5000),搖床上雜交1 h。 TBST 洗膜后,加入ECL 1 min,暗室顯影2 ～5 min,沖洗膠片。 結(jié)果掃描后,經(jīng)光密度分析系統(tǒng)計(jì)算灰度值(目的蛋白相對(duì)值=目的灰度值/GAPDH灰度值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,使用SPSS 16.0 版本軟件獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05 顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血壓結(jié)果

每?jī)芍軠y(cè)定血壓結(jié)果見(jiàn)圖1,結(jié)果顯示與WKY組相比,SHR 在6 ～32 周齡中血壓顯著升高(P＜0.01)。 卡托普利在16 ～26 周齡可顯著降低SHR血壓,停藥后該作用消失,血壓上升至SHR 空白水平。

注:與SHR 組相比,**P＜0.01。

2.2 左室質(zhì)量指數(shù)和血清含量

6、18、24 和32 周齡處理時(shí)結(jié)果見(jiàn)表1,SHR 在6 周齡時(shí)左室質(zhì)量指數(shù)已達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值,推測(cè)此時(shí)左室肥厚模型已建立[8]。 與WKY 組相比,隨著SHR 組左室質(zhì)量指數(shù)的升高,血清中NO2-濃度也得到了顯著提升(P＜0.05),說(shuō)明在SHR 高血壓進(jìn)程中,隨著周齡的增加,NO 過(guò)量生成,其可能是對(duì)高血壓引發(fā)心肌收縮力增加的一種代償機(jī)制。 卡托普利組18 周齡時(shí)對(duì)SHR 的左室質(zhì)量指數(shù)無(wú)顯著影響,但在24 周齡可顯著降低左室質(zhì)量指數(shù)和顯著升高血清NO2-水平(P＜0.05),說(shuō)明長(zhǎng)期服用卡托普利對(duì)減輕左室肥厚有較好的作用。

表1 卡托普利對(duì)不同周齡大鼠左心室指數(shù)和血清中亞硝酸含量的作用Table 1 Effect of Captopril to left ventricular mass index and concentration of NO2- of different ages of rats

2.3 不同周齡血管Ach 濃度依賴性血管舒張功能

6、18、24 和32 周齡處理時(shí)結(jié)果見(jiàn)圖2 和圖3,SHR 6 周齡的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能均完好。 跟SHR 6 周齡相比,胸主動(dòng)脈18 周齡舒張度顯著降低(P＜0.01),24 ～32 周齡進(jìn)一步降低,顯示年齡越大舒張度越低的趨勢(shì),但24 周齡后穩(wěn)定(圖2)。 與WKY 組相比,SHR 組各個(gè)時(shí)期的舒張度顯著降低(P＜0.01)。 卡托普利組在18 周齡時(shí)胸主動(dòng)脈的舒張度跟SHR 空白組比較顯著增大(P＜0.05)(圖3A)、24 周齡(圖3B)和32 周齡(圖3C)時(shí)差異無(wú)顯著。 說(shuō)明給予卡托普利在SHR 發(fā)病早期能顯著改善胸主動(dòng)脈舒張功能。

注:與6 周齡SHR 組相比,**P＜0.01。

注:A:18 周;B:24 周;C:32 周。 與SHR 組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.4 心肌和動(dòng)脈iNOS、eNOS mRNA 表達(dá)

18、24 和32 周齡處理時(shí)心肌和動(dòng)脈iNOS 和eNOS mRNA 表達(dá)見(jiàn)表2 及表3,結(jié)果顯示隨著周齡的增加,SHR 心肌和動(dòng)脈eNOS、iNOS mRNA 表達(dá)有升高趨勢(shì)(表2),其中eNOS/iNOS mRNA 最大值出現(xiàn)在18 周齡(表3),提示SHR 心肌在高血壓發(fā)生早期可能有eNOS 脫偶聯(lián)病理現(xiàn)象的存在。 另外數(shù)據(jù)顯示各周齡SHR 的eNOS 和iNOS mRNA 表達(dá)含量均顯著高于WKY 組(P＜0.05),且iNOS 較eNOS變化幅度更大,提示iNOS 的過(guò)度表達(dá)是SHR 心肌和動(dòng)脈在高血壓進(jìn)程中發(fā)生的一種代償機(jī)制。 給與卡托普利組干預(yù)后發(fā)現(xiàn)藥物能顯著降低24、32 周齡心肌、動(dòng)脈iNOS mRNA 表達(dá)(P＜0.05),同時(shí)顯著降低18、24、32 周心肌、動(dòng)脈eNOS mRNA 表達(dá)(P＜0.01)。 結(jié)果顯示隨著周齡的增加,SHR 心肌和動(dòng)脈iNOS mRNA 表達(dá)有升高趨勢(shì),而心肌和動(dòng)脈eNOS mRNA 表達(dá)在24 周時(shí)較低。 與WKY 相比,3個(gè)不同周齡的SHR 的心肌和動(dòng)脈iNOS 和eNOS mRNA 表達(dá)較高(P＜0.05)。 卡托普利組在24、32周齡時(shí)顯著降低心肌和動(dòng)脈iNOS mRNA 表達(dá)(P＜0.05)。 在3 個(gè)不同周齡時(shí)都能顯著降低心肌和動(dòng)脈eNOS mRNA 表達(dá)(P＜0.01)。 SHR 在18 周齡時(shí)心肌和動(dòng)脈eNOS mRNA 的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)iNOS mRNA 的表達(dá),分別為89.13 和123.52 倍。

表2 卡托普利對(duì)不同周齡心肌和動(dòng)脈iNOS and eNOS mRNA 的表達(dá)影響(n=6)Table 2 Effect of Captopril on heart and aorta iNOS and eNOS mRNA expression of different aged rats

表3 不同周齡SHR 心肌和動(dòng)脈eNOS 與iNOS mRNA 表達(dá)的比值比較Table 3 Heart and aorta eNOS/iNOS mRNA expression of different aged rats

2.5 心肌和動(dòng)脈iNOS、eNOS 蛋白表達(dá)18、24 和32 周齡處理時(shí)心肌和動(dòng)脈iNOS 蛋

白表達(dá)見(jiàn)圖4、圖5,結(jié)果顯示與WKY 相比,SHR動(dòng)脈在18、24、32 周齡,心肌在18、24 周齡iNOS蛋白表達(dá)較高(P＜0. 01),動(dòng)脈在24 周齡,心肌在18、24 周齡eNOS 蛋白表達(dá)較高(P＜0. 05)。卡托普利干預(yù)后,數(shù)據(jù)顯示藥物在18、24 周齡可顯著降低動(dòng)脈、心肌iNOS 蛋白表達(dá)(P＜0. 01);同時(shí)藥物在32 周齡顯著降低心肌iNOS 蛋白表達(dá)(P＜0. 01),在32 周齡顯著降低動(dòng)脈eNOS 蛋白表達(dá)(P＜0. 01)和升高心肌eNOS 蛋白表達(dá)(P＜0. 05)。

注:A: 心肌; B: 胸主動(dòng)脈。 與SHR 組iNOS 蛋白表達(dá)比較,**P＜0.01。

注:A: 心肌; B: 胸主動(dòng)脈。 與SHR 組eNOS 蛋白表達(dá)比較,**P＜0.01。

3 討論

SHR 在血壓動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程中存在著不同程度的左室肥厚及血管病變,具體表現(xiàn)在左室質(zhì)量指數(shù)的增加及動(dòng)脈Ach 濃度依賴性舒張作用較弱。 目前如何改善高血壓引起的靶器官損害已越來(lái)越受研究者關(guān)注,而一氧化氮合酶-一氧化氮系統(tǒng)更是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[9]。 NO 是一個(gè)活躍的反應(yīng)性分子,可通過(guò)檢測(cè)NO2-含量,在一定程度上正比反映微環(huán)境內(nèi)NO水平[10]。 研究表明在高血壓進(jìn)程中,eNOS 和iNOS對(duì)NO 的生成具有重要的影響[11]。 eNOS 存在于多種類型的細(xì)胞中,負(fù)責(zé)正常血管內(nèi)皮中NO 的產(chǎn)生,正常生理情況下,eNOS 催化合成的NO 參與維持循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)平衡,起到舒張血管、抑制血小板聚集黏附、血管平滑肌細(xì)胞增生等作用。 高血壓在病理狀態(tài)下,往往伴隨著eNOS 脫偶聯(lián)的現(xiàn)象,此時(shí)eNOS 不再產(chǎn)生NO 而是產(chǎn)生大量的氧自由基,而且過(guò)氧化氫能夠刺激eNOS 在血管壁的過(guò)度增加,具有一定的毒性[12]。 iNOS 只在病理狀態(tài)下誘導(dǎo),幾秒中即大量合成NO,數(shù)量可達(dá)10-9～10-6mol/L,此過(guò)程遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)eNOS 所產(chǎn)生的NO,其產(chǎn)生的NO 可通過(guò)殺死微生物起到抗腫瘤、抗菌和其它侵入微生物等起到宿主防御作用,同時(shí)iNOS 產(chǎn)生的過(guò)量NO 又具有一定的細(xì)胞毒性作用。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,我們推測(cè)在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中,高血壓引起心肌肥厚及血管擴(kuò)張導(dǎo)致eNOS 和iNOS 過(guò)度產(chǎn)生,而eNOS 和iNOS 過(guò)度表達(dá)是對(duì)產(chǎn)生大量NO 的一種反饋機(jī)制,其在一定程度上保護(hù)了高血壓進(jìn)程中血壓增高對(duì)心臟和動(dòng)脈的進(jìn)一步損傷[13]。 然而,在SHR 高血壓進(jìn)程中,具體是eNOS 或者iNOS 還是兩者共同作用生成NO 存在著一定的爭(zhēng)議[14]。 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,18 周齡時(shí)eNOS mRNA 的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于iNOS mRNA 的表達(dá);24 周齡時(shí),心肌和動(dòng)脈iNOS mRNA 和蛋白的表達(dá)均較高,而心肌和動(dòng)脈eNOS mRNA 和蛋白的表達(dá)均較低,而且eNOS/iNOS mRNA 的比例達(dá)到了比較穩(wěn)定的數(shù)值,此時(shí)SHR 血清NO2-濃度明顯高于WKY。 綜合本研究我們推測(cè):在SHR 早期NO 主要由eNOS 產(chǎn)生,SHR 后期(24 ～32 周齡以后)NO 主要由iNOS 產(chǎn)生。 本研究還對(duì)卡托普利的作用方式進(jìn)行了新的研究和分析,發(fā)現(xiàn)卡托普利在一定程度上能改善左室肥厚及血管內(nèi)皮功能,18、24 周齡能夠顯著降低SHR 動(dòng)脈iNOS 的表達(dá)水平,停藥后作用消失,在24、32 周齡顯著降低SHR 心肌iNOS 的表達(dá)水平,對(duì)eNOS 的mRNA 有改善作用,而對(duì)蛋白基本無(wú)作用,推測(cè)卡托普利對(duì)動(dòng)脈的調(diào)節(jié)作用早于心肌,可能主要干預(yù)iNOS 過(guò)度表達(dá)而改善心肌和動(dòng)脈的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著高血壓進(jìn)程的發(fā)展,iNOS 和eNOS 的表達(dá)會(huì)隨著病情發(fā)展過(guò)度增加,同時(shí)病理狀態(tài)下誘導(dǎo)iNOS 和eNOS 在體內(nèi)的大量積聚反過(guò)來(lái)影響高血壓的發(fā)生。 卡托普利能一定程度上抑制體內(nèi)iNOS 和eNOS 的表達(dá)。 高血壓心臟和血管病變與一氧化氮合酶存在一定的相關(guān)性,通過(guò)改善一氧化氮合酶-一氧化氮系統(tǒng)以改善心肌和動(dòng)脈的功能,為治療高血壓提供一個(gè)新的思路。