外源性誘導(dǎo)原發(fā)性膽汁性膽管炎動物模型研究進展

陳海洋張 瑋

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 感染科,上海 200032)

原發(fā)性膽汁性膽管炎( primary biliary cholangitis, PBC),又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化,是一種慢性肝內(nèi)膽汁淤積性肝病,其特征是肝內(nèi)小膽管破壞,門脈周圍炎癥、纖維化,最終導(dǎo)致肝硬化。PBC 的血清學(xué)特征是抗線粒體抗體( antimitochondrial antibody, AMA)陽性,這是一種在約95%的PBC 患者中發(fā)現(xiàn)的高度疾病特異性抗體[1]。多個國家流行病學(xué)研究表明PBC 的總體發(fā)病率為8.55/100 萬/年,患病率為118.75/100 萬/年,我國目前無論是發(fā)病率還是患病率都要高出平均水平[2]。 國外流行病學(xué)顯示尿路感染、香煙、有毒廢棄物和工業(yè)地區(qū)等環(huán)境污染以及貧困等因素容易誘發(fā)本病[3-5]。 Chen 等[6]在對上海部分地區(qū)19012名居民抗線粒體抗體M2 亞型(anti-mitochondrial antibody subtype M2, AMA-M2)的篩選調(diào)查中發(fā)現(xiàn)住在垃圾填埋場和高架附近,吸煙以及使用染發(fā)劑等被認(rèn)為是危險因素。 最新流行病學(xué)也顯示城市工業(yè)區(qū),環(huán)境污染和社會貧困地區(qū)人群的PBC 患病率較高[5]。 Probert 等[7]在垃圾填埋場發(fā)現(xiàn)了可以抑制線粒體氧化磷酸化和誘導(dǎo)肝祖細胞凋亡的化學(xué)物質(zhì),其結(jié)構(gòu)是一種類似硫辛酸的人肝細胞代謝產(chǎn)物,并且可以通過外源性脂?；緩皆诿复呋屡c丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2 成分相結(jié)合。 多項研究顯示外源性化學(xué)藥物或異物可能通過修飾丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2 亞單位(pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit, PDC-E2)或其他自身抗原,導(dǎo)致自身免疫易感個體耐受性喪失從而誘發(fā)PBC 的發(fā)病[8-9]。 外源性誘導(dǎo)動物模型更加類似環(huán)境因素對PBC 發(fā)病的影響,所以有必要對外源性誘導(dǎo)PBC動物模型的方法和特點進行系統(tǒng)總結(jié)(見表1),以便根據(jù)研究目的選擇恰當(dāng)?shù)哪Ｐ汀?/p>

表1 不同外源性物質(zhì)誘導(dǎo)PBC 動物模型總結(jié)Table 1 Summary of animal models of PBC induced by different exogenous substances

1 藥物誘導(dǎo)模型

1.1 2-辛炔酸偶聯(lián)牛血清白蛋白(2-octynoic acid BSA conjugate, 2-OA-BSA)誘導(dǎo)模型

絕大多數(shù)PBC 患者都伴有不同程度的抗線粒體抗體反應(yīng),這些抗體識別的自身抗原是2-氧酸脫氫酶復(fù)合體(2-oxo-acid dehydrogenase complex, 2-OADC)的成員,特別是PDC-E2。 實際上,這些抗體也會與許多化學(xué)修飾過的類似物發(fā)生交叉反應(yīng)[9,24]。 2-辛炔酸(2-octynoic acid, 2-OA)不僅具有在體內(nèi)修飾PDC-E2 的潛力,而且重要的是,它被廣泛應(yīng)用于環(huán)境中,包括香水、口紅等化妝品和許多常見的食品調(diào)味料中[9]。

Wakabayashi 等[10]首先使用外源性2-OA 與牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)偶合(100 μg/25 μL),對雌性C57BL/6 小鼠進行免疫,成功誘導(dǎo)出類PBC 動物模型。 造模方法:2-OA-BSA 與完全弗氏佐劑(Freund’s adjuvant complete, CFA)偶合,進行首次腹腔注射,其后將2-OA-BSA 與不完全弗氏佐劑(Freund’s adjuvant incomplete, IFA)進行偶合,每隔2 周對模型小鼠腹腔注射1 次,持續(xù)12～24 周。 模型特征:最早在免疫4 周后血清中即可檢測到PDC-E2 抗體陽性并顯著升高,8 周即達100%。 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNFα)和干擾素γ(interferon-gamma, IFN-γ)在免疫4周后也顯著增高。 IL-4、IL-5 和IL-10 基本沒有變化。 組織學(xué)上免疫14 周后肝切片顯示門管區(qū)淋巴細胞浸潤,小膽管損傷或消失,肝內(nèi)或見肉芽腫形成。 肝內(nèi)CD4/CD8T 細胞的比值降低,而CD8+T 細胞的數(shù)量顯著增加。 Lleo 等[11]發(fā)現(xiàn)在PBC 患者中,受損膽管周圍的門管區(qū)也存在典型的CD4+T 和CD8+T 淋巴細胞浸潤。 雖然該模型有PBC 典型膽管周圍淋巴細胞浸潤,但是纖維化改變和反映膽汁淤積程度的相關(guān)酶測定卻仍然存在缺陷。 然而,2-OA 可用于多種小鼠品系和轉(zhuǎn)基因小鼠[25-26],達到模型的理想病理改變,也表明2-OA 誘導(dǎo)模型的廣泛應(yīng)用前景,值得進一步探索。

Wu 等[12]、Chang 等[13]發(fā)現(xiàn)半乳糖苷基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)激活iNKT 細胞會加重匯管區(qū)炎癥反應(yīng)、膽管損傷、肉芽腫形成和肝纖維化發(fā)生的趨勢。所以Chang 等[14]修改造模的實驗方案,除以上干預(yù)措施外,另加α-GalCer 用0.5%吐溫20 溶解成0.2 mg/mL,取10 μL 分別于第1、2、3 次免疫接種的前1 d 靜脈注射至小鼠體內(nèi)。 方案修改后造模小鼠在免疫4 周后即出現(xiàn)更加明顯的門脈炎癥、膽管損傷。更為欣喜的是修正后12 周的模型可提高AMA 產(chǎn)生,肉芽腫形成和肝纖維化改變征象。 Zeng 等[27]、Miyake 等[28]根據(jù)這種免疫小鼠模型還發(fā)現(xiàn)iNKT細胞和自身抗體的關(guān)系也具有一致性。 這個發(fā)現(xiàn)說明不僅適應(yīng)性免疫參與PBC 的發(fā)展,而且先天性免疫在本病的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用。

1.2 聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyinosinicpolycytidylic acid , polyI:C)誘導(dǎo)模型

PolyI:C 是一種干擾素誘導(dǎo)劑,觸發(fā)I 型干擾素(IFN-1)的產(chǎn)生和下游IFN-α/β 受體依賴信號通路,通過打破人體耐受性促進后續(xù)自身免疫反應(yīng)[29-31]。 持續(xù)產(chǎn)生IFN-1 會使免疫系統(tǒng)幾乎所有成分轉(zhuǎn)向病理功能,導(dǎo)致組織損傷和疾病[32]。 許多系統(tǒng)性自身免疫性疾病患者有持續(xù)產(chǎn)生IFN-1 的跡象,并顯示IFN-α 調(diào)控基因表達增加[33-34]。 此外,多個病例報道在沒有自身免疫性疾病的情況下使用干擾素治療期間患者出現(xiàn)了自身免疫性肝炎的臨床和病理特征[35-37]。 提示IFN 系統(tǒng)在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。

Okada 等[15]使用IFN-1 的誘導(dǎo)劑polyI:C 建立自身免疫性膽管炎動物模型。 造模方式:6 ～8 周的雌性C57BL/6 小鼠,每周腹腔注射2 次polyI:C,以5 mg/kg 為造模最佳濃度,連續(xù)造模28 周,成功建立PBC 小鼠模型。 模型特點:造模8 周后組織學(xué)可見膽管損傷,膽管周圍淋巴細胞浸潤明顯,門管區(qū)淋巴細胞的浸潤數(shù)量在造模16 周達到最高,此后基本穩(wěn)定維持這一水平。 模型小鼠血清在8 周后可以檢測到自身抗體,到24 周后87%的模型小鼠可檢測AMA。 此外,IFN-α 在造模4 周已經(jīng)高表達,但到16周后開始降低,24 周處于較低的狀態(tài)。 Hanada等[38]認(rèn)為IFN-β 和IFN-α 可以直接破壞膽管細胞緊密連接的屏障功能,通過改變膽管細胞旁路途徑來增加膽管細胞通透性。 然而Stewart[16]認(rèn)為降低干擾素會減少自身抗體和組織免疫損傷,IFN-α 低表達的情況下,IFN-β 也會出現(xiàn)低表達。 奇怪的是這種現(xiàn)象與病理進展相互矛盾,可能是因為其他細胞因子對干擾素的調(diào)節(jié)所致,至于具體內(nèi)在聯(lián)系仍需進一步研究。

1.3 2OA-BSA 聯(lián)合polyI:C 誘導(dǎo)模型

Ambrosini 等[17]認(rèn)為2OA-BSA 誘導(dǎo)的PBC 模型肝纖維化的病理特征不符合后期肝纖維化的病理征象,所以在此基礎(chǔ)之上聯(lián)合polyI:C,達到了較好的效果。 造模方法:在首次2OA-BSA 聯(lián)合CFA腹腔注射誘導(dǎo)后每3 d 加用5 mg/kg 劑量的polyI:C,干預(yù)8 周后處死小鼠。 和2OA-BSA 誘導(dǎo)模型相比有以下異同。 相同:兩者肝組織有相同程度的淋巴細胞浸潤、肉芽腫形成和膽管損傷。 兩者產(chǎn)生的抗體和CD4+T 細胞水平相當(dāng)。 不同點:聯(lián)合polyI:C 誘導(dǎo)的模型Th1 細胞因子、IL-12、IFN-γ 和TNF-α增多,CD8+T 細胞和嗜酸粒細胞數(shù)量增多,門脈匯管區(qū)炎癥和纖維化形成明顯,此外造模時間只需要8 周。 但是polyI:C 可有效激活免疫系統(tǒng),聯(lián)合使用后促使造成嚴(yán)重的腹腔炎癥,提高了動物死亡率。polyI:C 在2OA 免疫誘導(dǎo)下進行二次免疫,證實PBC 如同其他自身免疫性疾病一樣,屬于多系統(tǒng)協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)。

2 抗原誘導(dǎo)模型

2.1 微生物誘導(dǎo)模型

流行病學(xué)研究表明PBC 與復(fù)發(fā)性尿路感染有關(guān)[39-40]。 Selmi 等[41]發(fā) 現(xiàn) PBC 患 者 血 清 對

(Novosphingobiumaromaticivorans,N.aromaticivorans) 的反應(yīng)活性比對大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli)要高出100～1000 倍。 其后又進一步將N. aromaticivorans、E. coli等多種細菌的PDC-E2 內(nèi)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)前者與人類的PDC-E2 具有最高的同源性,并且在對比幾種細菌誘導(dǎo)PBC 模型特點后,認(rèn)為N. aromaticivorans比之前提出的E. coli、螺桿菌(Helicobacter species, Hp)要更可能誘導(dǎo)PBC 的發(fā)病[42]。

Mattner 等[18]使用N. aromaticivorans打破免疫耐受造出具有顯著自身免疫特點的PBC 小鼠模型。造模方法如下:制備N. aromaticivorans細菌懸液(每100 μL 含有5×107個)。 分別于第1 天和第14 天將細菌懸液靜脈注射到4 ～20 周非肥胖型糖尿病(non-obesity diabetes, NOD)小鼠體內(nèi)進行活體感染。 模型特點:活體感染1 個月后小鼠肝脾質(zhì)量較前增加; 主要組織相容性復(fù)合體( major histocompatibility complex, MHC)II 類分子在受損小膽管的表達;可見嚴(yán)重的門脈浸潤和膽管損傷,并伴有部分纖維化改變。 這種表現(xiàn)在感染E. coli的小鼠肝組織中未發(fā)現(xiàn)。 造模6 個月后門脈炎癥、膽管損傷和肉芽腫形成相比E. coli感染要具有明顯差異。 血清檢測表明感染2 周后小鼠即出現(xiàn)PDCE2 和AMA 的聚集,伴有T 淋巴細胞浸潤小膽管的現(xiàn)象,并持續(xù)長時間高水平的IgG。 盡管如此,這種模型卻未出現(xiàn)與人類PBC 發(fā)展進程中相似的肝纖維化表現(xiàn)。 但有研究表明這種肝纖維化改變不明顯可能是由于NOD 遺傳背景之下IFN 的高表達[43]。 這也提示PBC 疾病的發(fā)生可能與某種遺傳易感性基因有關(guān)。 Wang 等[19]分別用E. coli和N.aromaticivorans感染NOD 小鼠建立PBC 模型,發(fā)現(xiàn)E. coli感染小鼠會導(dǎo)致更加明顯的膽管炎癥損傷并且產(chǎn)生更高濃度的AMA,然而與PBC 患者血清相比,E. coli感染小鼠對PDC-E2 的血清學(xué)抗體反應(yīng)卻相對較弱[44],盡管如此Wang 認(rèn)為在感染E. coli的早期足以打破免疫耐受并導(dǎo)致類似于PBC 的肝病理表現(xiàn)。

2.2 抗線粒體抗體抗原(AMA 抗原)誘導(dǎo)模型

英國的一項臨床研究發(fā)現(xiàn)檢出M2 抗體陽性的無癥狀患者在出現(xiàn)PBC 癥狀和體征之前,時間間隔長達10 余年之久[45]。 目前依靠常規(guī)使用的血清AMA 檢測,其特異性和敏感性還不夠,仍有一部分病人出現(xiàn)漏診[46]。 所以提高對PBC 診斷的敏感性顯得尤為重要。 Kikuchi[47]和Miyakawa 等[48]將AMA 反應(yīng)的主要自身抗原克隆并鑒定為2-氧代酸脫氫酶復(fù)合體家族成員:丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2(PDC-E2), 支鏈 2-氧代酸脫氫酶復(fù)合體-E2(BCOADC-E2) 和2-氧戌二酸脫氫酶復(fù)合體-E2(OGDC-E2)。 并且也發(fā)現(xiàn)有些患者的血清與BCOADC-E2 和OGDC-E2 是可以反應(yīng)的。 多年前Moteki 等[49]將牛、大鼠和人類線粒體抗原的混合物,即3 個不同支鏈結(jié)構(gòu)域雜交克隆,命名為pMLMIT3,用于PBC 病人檢測發(fā)現(xiàn)可以明顯提高檢出率。

Jiang 等[20]根據(jù)基因工程的方法將人源靶抗原連接加工后獲得重組抗原蛋白三聯(lián)體(重組AMA抗原),據(jù)此成功模擬PBC 模型[21]。 造模方法:每只小鼠(C57BL/6)一次腹腔注射重組抗原蛋白三聯(lián)體100 μg/200 μL。 模型特點:在免疫66 周后病理顯示肝小葉無明顯淋巴細胞浸潤和肝細胞壞死表現(xiàn),并且可見匯管區(qū)淋巴細胞浸潤和小膽管損傷。血清中AMA-M2 抗體陽性率達100%,并且谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBil)無明顯變化,以上特征與早期PBC 相似。 此外具有肝特異性,靈敏度高,已嘗試投入臨床用于輔助PBC 疾病的篩查[22]。Miyakawa 等[50]通過克隆人源cDNA 利用新開發(fā)的酶聯(lián)免疫吸附法來表達重組蛋白,用于PBC 陰性病人的檢測,有90%與至少1 個重組蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)。

2.3 膽管蛋白(bile duct protein, BDP)誘導(dǎo)模型

根據(jù)PBC 發(fā)病的典型特征,Ma 等[23]通過同源BDP 免疫誘導(dǎo)方式建立PBC 小鼠模型。 造模方法:8～12 周齡小鼠(C57BL/6)通過門靜脈灌注原位膠原酶IV,10 min 后剪裁肝,用軟牙刷刷去肝細胞,直到可見整個膽管樹。 將膽管樹置于原位膠原酶IV中震蕩10 min,分離粘附的肝細胞。 在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌3 次后,將膽管樹置于PBS,制備膽管細胞蛋白勻漿,并進行蛋白定量。 將4 mg/mL的BDP 與CFA 等體積乳化,完全乳化后,取BDPCFA 乳劑在小鼠背部多點皮下注射,每周1 次,免疫3 次。 隨后將BDP 與IFA 乳化,BDP-IFA 乳劑僅在最后一次免疫中使用,BDP-IFA 處理1 周后處死小鼠,進行分析。 模型特點:在病理中發(fā)現(xiàn)門靜脈匯管區(qū)膽管周圍嚴(yán)重的肝特異性炎癥,肝和脾中CD4+T 和CD8+T 細胞的數(shù)量和激活狀態(tài)增加。 以及由T 細胞抗原呈遞細胞組成的樹突狀細胞在肝和脾的數(shù)量也有所增加。 此外,該模型中脾的生發(fā)中心反應(yīng)更強。 血清中AMAs 100%陽性,并增加了血清中的AMAs,包括抗PDC-E2、BCOADC-E2 和OGDC-E2。 該模型的建立主要依賴于膽管抗原,而在人類中,膽管抗原再次表明分子擬態(tài)參與觸發(fā)或促進PBC 發(fā)病。

3 討論與展望

除了臨床樣本、環(huán)境研究、體外實驗和流行病學(xué)數(shù)據(jù)外,動物模型是理解和尋找PBC 臨床方案不可或缺的工具。 到目前為止,PBC 的發(fā)病機制仍然不夠清晰,只是對該疾病發(fā)展過程和預(yù)后有一定了解。 熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是唯一經(jīng)FDA 認(rèn)證的一線藥物[51],但也只能改善患者膽汁淤積的狀態(tài),無法根本治愈。 在實際臨床中有高達30%的PBC 患者對UDCA 應(yīng)答欠佳,應(yīng)答欠佳不僅會提高并發(fā)癥的發(fā)生率,更容易進展為肝硬化,甚至需要肝移植,這類患者是快速發(fā)展至晚期肝病的高風(fēng)險人群[52-54]。 臨床二線貝特類藥物聯(lián)合UDCA 也僅僅可以改善血清相關(guān)指標(biāo),與單獨使用UDCA 相比,對癥狀和死亡率的影響并沒有顯著差異[55]。 因此,當(dāng)務(wù)之急在于盡早探明本病的發(fā)病機制以研發(fā)更適合PBC 的新藥。

目前建立的動物模型只能模擬PBC 某一病理階段,還不能完整模擬其病理過程。 人體生活在復(fù)雜環(huán)境中,自身免疫性疾病是環(huán)境多因素刺激和遺傳因素導(dǎo)致免疫耐受破壞所致。 以上構(gòu)建的小鼠模型各有特點,啟示我們單因素造模方法只能擬合出接近PBC 某一階段病理特點的動物模型,聯(lián)合使用比如2OA-BSA 聯(lián)合polyI:C 可以較好提高動物模型擬合度。 對于這種病理過程復(fù)雜的疾病模型應(yīng)該打破傳統(tǒng)單因素造模思路,從多因素(不局限外源性誘導(dǎo))考慮,或者結(jié)合肝纖維化、肝硬化疾病動物模型造模方法,采取復(fù)合多因素造模方法,探索出更加符合人類PBC 發(fā)病特點的動物模型。