禽腺病毒研究進展

劉 洋 崔松奇 張丹丹 李 娥

（豪威生物科技有限公司，天津 301700）

0 引言

禽腺病毒（Fowl Adenovirus，FAdV）屬于腺病毒科，為雙鏈DNA 病毒，是一種常見的禽致病性病原體，可引發雞群感染包涵體肝炎（Inclusion Body Hepatitis，IBH）及 心 包 積 水綜 合 征（Hepatitises-Hydropericardium Syndrome，HPS）等疾病。禽腺病毒病在世界各地均有發生，一旦發病，會給養殖戶帶來巨大的損失。所以，高效、準確地診斷和預防禽腺病毒病極為重要，可有效防止疾病的傳播。

1 禽腺病毒概述

1.1 禽腺病毒的分類

根據國際病毒分類委員會（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第10 次報告，目前禽腺病毒屬共有14 個成員，分別為鴨腺病毒B，隼腺病毒A，鵝腺病毒A，鴿腺病毒A、B，鸚鵡腺病毒B，火雞腺病毒B、C、D，禽腺病毒A、B、C、D、E。禽腺病毒共有14 個血清型，如表1 所示。禽腺病毒在雞群中的感染現象普遍存在，在鵝、鴨、火雞、鴿、鸚鵡、珍珠雞及鴕鳥中也有腺病毒分離的報道。

表1 禽腺病毒屬內種和血清型

1.2 傳播

禽腺病毒的傳播主要分為垂直傳播和水平傳播。通常，由染病雞群的胚孵化而來的雛雞中腺病毒檢出率較高。一般雞感染腺病毒后的排毒高峰在感染后的35 ～63 d，而產蛋高峰也會出現反復排毒的現象。腺病毒可以存在于感染雞的咽喉、心臟、尿液、精液、糞便及肝臟。其中，染病雞咽喉部的病毒通過呼吸釋放到空氣中，引起環境空氣污染；或者糞便中的腺病毒可通過排泄物釋放到環境中，造成飲水及飼料污染，均會引起腺病毒水平傳播。因此，糞口途徑是腺病毒傳播的重要方式之一。另外，疫苗污染可能也是造成雞群普遍感染腺病毒的原因之一。

1.3 病原性

大部分禽腺病毒可在健康禽類體內復制，自然感染時癥狀輕微或無感染癥狀，但雞傳染性貧血病毒、馬立克病病毒、傳染性法氏囊病病毒、新城疫病毒混合感染時，禽腺病毒的致病性增強，與腺聯細小病毒混合感染時，禽腺病毒的致病性則有所下降。

1.4 致病性

1.4.1 包涵體肝炎（IBH）。腺病毒I 群中FAdV-4 通常可引起雞只包涵體肝炎發生。發病雞只羽毛凌亂，萎靡蜷縮，48 h 內死亡或逐漸恢復。該病死亡率為10%～30%，多發于21～49日齡肉雞。另外，鴿、鸚鵡、荼隼等也會感染腺病毒性包涵體肝炎。

1.4.2 心包積水綜合征（HPS）。其也叫安卡拉病，FAdV-4 常引起心包積水綜合征。發病雞只羽毛凌亂，萎靡蜷縮。臨床剖檢已發病雞只，可見心包膜內出現無色或淡黃色水樣或膠凍樣積液。該病死亡率為20%～80%，肉雞多發。

2 禽腺病毒診斷和防治研究進展

已知禽腺病毒I 群血清型較多，近10 年我國雞群中禽腺病毒感染主要是血清型FAdV-4、FAdV-8a/b 和FAdV-11 型，其中FAdV-4 型 致 病 性 最 強。FAdV-4 的傳統診斷方法是將病毒分離后進行血清學檢測，檢測周期長，不同血清型或同一血清型不同毒株檢出率較低。近年來，發現應用分子生物學技術方法在病原體檢測方面的準確率及效率較高，應用越來越多。對于禽Ⅰ群腺病毒的防控，目前我國主要采取疫苗免疫與卵黃抗體防治結合的方式。

2.1 診斷

2.1.1 臨床癥狀。結合發病史初步診斷，再通過病理學觀察進一步確診。對發病雞進行解剖，病變主要出現在肝臟、心臟和腎臟等部位。肝部組織顏色黃染、腫脹、質脆，可見點狀出血點或膠凍樣附著物等，或者出現心包積水情況；心臟部位多見淡黃色積液或出現局灶性壞死；腎臟腫大、有出血點或花斑腎，甚至會出現尿酸鹽沉積現象。

2.1.2 病毒分離。可通過雞胚進行分離培養，準確性較高，但檢測周期長。雞胚方式是經過尿囊腔接種9 ～10 日齡SPF 雞胚，每枚接種200 μL 后，2 ～ 5 d 可見雞胚不同程度病變，進而將臨床疑似雞包涵體肝炎病例的肝組織再次接種到SPF 雞胚中，連續盲傳3 代，發現雞胚在一定時間出現死亡或產生病變，與正常雞胚相比，死亡胚體較正常雞胚小，未死亡雞胚較正常、但雞胚通體腫大，取死亡雞胚即分離得到腺病毒。細胞方式是采集病雞肝臟，剪碎研磨過濾除菌后按照10%接入正常培養的LMH 細胞中，細胞培養基換成維持液后培養病毒2 ～5 d，觀察細胞病變出現情況，若出現細胞病變，盲傳3 代，均出現細胞病變則將細胞凍融3 次，即獲得病毒。

2.1.3 血清學診斷。該方法包括酶聯免疫吸 附 試 驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、血清中和試驗和瓊脂擴散試驗（Agar Gel Precipitation，AGP）。劉延珂等通過誘導表達FAdV-4 中的Fiber 蛋白，將其包被成抗原，建成了檢測FAdV-4 抗體的間接ELISA 方法，重復性及敏感性均較好。病毒中和試驗特異性和敏感性較強，可用于病原鑒定、分型、檢測抗體及分群等。智海東等利用AGP 方法檢測腺病毒陽性血清樣本，最早可以在8 ～12 h 出現沉淀線，實用性較強。

2.1.4 分子生物學診斷。該方法包括普通聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）等。近年來，PCR 診斷禽腺病毒的應用越來越多，該方法因特異性、敏感性和檢測效率高等較受歡迎。PCR 方法能在疾病早期通過咽拭子及泄殖腔拭子采樣檢測出感染病雞，更早確診。因禽腺病毒Hexon 基因高度保守，可根據保守基因設計PCR 引物。例如，向文彬等根據GenBank 中已發表的FAdV 的全基因組序列，以病毒Hexon 基因保守序列設計引物，PCR 檢測結果顯示，該引物可用于FAdV-4、FAdV-8、FAdV-11 的診斷。Real-time PCR與普通PCR 的區別在于能定量檢測病毒，敏感性和特異性更高。其常用的方法是SYBR Green I 染料和Taq Man 探針2 種。其中，SYBR Green I 染料可以與所有DNA 雙鏈結合，優點是價格較探針方式便宜，且免去設計探針的工作，但由于存在染料與體系種的非特異性產物易結合的特點，易出現假陽性現象。Taq Man 探針則特異性和敏感性更好，但需要設計探針，成本相對較高。夏夢圓等根據禽腺病毒Hexon基因設計出特異性引物，建立了SYBR Green I 實時熒光定檢測I 群4 型禽腺病毒的方法，可重復性較好。羅洋洋等根據禽腺病毒Hexon 基因設計出特異性引物和探針，建立了TaqMan 探針Real-time PCR 方法，用于FAdV-4 的診斷，其結果較普通PCR 更靈敏，檢出率提高10%。LAMP 技術較普通PCR 更為簡便，無須模板熱變性、長時間循環、電泳、紫外成像等過程，具有簡單、快速、特異性強等特點。唐熠等根據禽腺病毒Hexon 基因設計一套特異性LAMP 引物，建立LAMP 快速檢測I 群4 型禽腺病毒的方法。

2.2 疫苗

全病毒滅活疫苗是指用β-丙內酯或福爾馬林滅活病毒輔以佐劑制成的疫苗。阮繼湘等研究發現新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒病（Ⅰ群，4 型）三聯滅活疫苗分別免疫7、14、21 日齡的SPF 雛雞和商品雛雞，免疫后21 d 用禽腺病毒（Ⅰ群，4 型）強毒攻擊，結果顯示FAdV 攻毒保護率均為100%。另外，FAdV-4 油乳劑滅活疫苗可以有效預防IBH。免疫后攻毒解剖SPF 雞，心臟、肝臟等無病變情況，而人工攻毒的SPF 雞只存在心包積液及肝臟黃染等情況。

亞單位疫苗是指利用DNA 重組技術，將編碼病原微生物保護性抗原的基因導入受體（菌或細胞），使其高效表達，而后提取保護性抗原，加入佐劑后而制成的疫苗。基因工程亞單位疫苗通常只含病原體的一種或幾種只產生保護性免疫應答所必需的免疫原成分。WANG 等用大腸埃希菌表達了FAdV-4 的六鄰體蛋白、五鄰體蛋白、Fiber-1 和Fiber-2，通過動物試驗比較各蛋白的免疫保護效果，結果顯示Fiber-2的保護效果最好，從而說明表達蛋白的選擇直接影響亞單位疫苗的效果。欒慶東等成功表達了4 種我國主要流行血清型FAdV 的可溶性Fiber 蛋白，采用LMH 細胞接毒培養，而后開展交叉中和試驗，結果表明FAdV-4、FAdV-8b 和FAdV-11 Fiber 蛋白抗血清對其他血清型病毒的感染無交叉中和作用，證明在細胞水平上這3 種血清型FAdV 全病毒間的交叉中和反應與Fiber 蛋白無關。

截至2021 年12 月，我國全病毒滅活疫苗數量占比仍然較大。近年來，亞單位疫苗的研制數量逐漸增多。禽腺病毒新獸藥注冊三聯苗2 項，均為雞新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4 型）三聯滅活疫苗，其中腺病毒部分是不同毒株的全病毒滅活疫苗，已生產上市。目前，已通過臨床試驗審批的禽腺病毒的禽腺病毒滅活疫苗共31 余項，主要是三聯滅活疫苗、四聯滅活疫苗。可以肯定的是，禽腺病毒多聯滅活疫苗更受市場歡迎，可替代性低。

2.3 卵黃抗體

卵黃抗體是禽類在免疫適量抗原后產生的特異性抗體，對于病毒具有較好的治療和預防效果。楊曉偉等制備的抗禽腺病毒I 群4 型卵黃抗體，每只使用0.3 mL/只可保護15 日齡肉雞不發病，且每只使用劑量分別為0.8 mL、1.0 mL 每只時，患病雞治愈率分別為86.7%和96.7%，表明制備的卵黃抗體有較好的預防與治療作用。杜東穎等經誘導表達FAdV-4型Fiber-2 蛋白，制成免疫原后免疫產蛋雞，收獲高免蛋，經提純獲得的精制卵黃抗體，用其注射SPF 雞進行免疫效果評價。結果表明，精制卵黃抗體經肌肉或皮下注射SPF 雞，注射后7 d 內可保護雞群抵抗禽腺病毒（C 種，4 型）強毒株的攻擊，人工攻毒后24 h 內在每只雞肌肉或皮下注射抗體1.0 mL，可為感染雞提供90%～100%的保護。

截至2021 年12 月，已通過臨床試驗審批的禽腺病毒卵黃抗體共4 項。隨著腺病毒發病率逐年遞增，腺病毒防控產品市場空間較大，提示相關研究人員需要以市場需求為導向，聚焦禽腺病毒卵黃抗體的研究，提前規劃布局，時刻為服務市場做準備。

3 研究展望

對于腺病毒的防控，要嚴格選用與流行株匹配的免疫原，而且需要迎合市場需求開發禽腺病毒多聯滅活疫苗。目前，大多數Ⅰ群腺病毒不同血清型間的混合感染及禽腺病毒與其他病原體混合感染造成的腺病毒致病性增強方面的研究不夠深入，需要系統研究腺病毒I 群不同血清型疫苗的致病力及交叉保護效力。因安全性和穩定性好，卵黃抗體逐漸成為養殖戶預防和治療禽腺病毒的選擇。即使卵黃抗體優點很多，但仍需優化實際生產中酸化、萃取、提取卵黃抗體的工藝，還需要開發出低成本且預防效果良好的卵黃抗體，來有效防控Ⅰ群禽腺病毒感染。目前，養殖過程中經常存在混合感染的情況，市場上單抗品種居多，而能同時抗多種病毒或者同種病毒不同型的產品相對較少，因此，研究抗多種疫病或多血清型病毒將成為一種趨勢。禽腺病毒多聯滅活疫苗一針防多病，再結合禽腺病毒卵黃抗體應用，將會獲得更好的防疫 效果。