急性期川崎病患兒血清外泌體蛋白質組學的前瞻性研究

張帆 張欠文 王娜娜 劉倩 沈潔 侯淼 孫凌 呂海濤 嚴文華 黃潔

（蘇州大學附屬兒童醫院 1.心內科；2.呼吸科，江蘇蘇州 215003）

川崎病（Kawasaki diease，KD）是一種好發于5歲以下兒童、累及中小動脈的血管炎癥疾病，至今發病原因不明；在發達國家中，KD已取代風濕性疾病成為兒童獲得性心臟病的首要病因［1］。在臨床工作中我們發現部分KD患兒病程早期僅以發熱為主要表現，缺乏典型癥狀，難與細菌性感染疾病相鑒別，導致這類患兒診斷延誤且不必要地使用了抗生素，最終增加了出現心血管并發癥如冠狀動脈損傷的風險［2-4］；近些年許多研究致力于探索補充診斷KD的生物標志物，以期對疾病進行早期診斷并評估疾病預后。蛋白質組學由于可識別基于mRNA 層面未能揭示的疾病的特性被廣泛應用于生物標志物和疾病發病機制的研究中。此外，在對外泌體深入研究后發現：外泌體囊泡中的蛋白質理化性質穩定不易受到內環境影響，蛋白質成分可能與疾病發病及預后相關［5-8］；蛋白質組學的優勢及外泌體的特質為在外泌體蛋白中尋找生物標志物奠定了基礎［9-10］。本研究通過分析急性期KD患兒血清外泌體蛋白，篩選差異蛋白并進行生物信息分析，尋找補充診斷KD 的生物標志物；并在蛋白質組學分析背景下對KD與細菌性感染患兒提供了全面的血清外泌體蛋白質組圖譜，為KD的診斷提供了新線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取 2019 年 6 月至 2020 年 8 月于我院治療的KD 患兒（n=13）納入KD 組；同期選取因細菌感染入我院治療的患兒（n=13）納入感染對照組。KD組入組標準：（1）符合2017年美國心臟協會制定的KD科學申明［1］；（2）病程處于急性期（＜10 d）；（3）病史資料完整。排除標準：病程大于10 d，入院前已接受丙種球蛋白、激素治療的患兒。感染對照組入組標準：（1）以發熱為主要表現；（2）明確細菌感染證據，實驗室檢查白細胞計數≥15×109/L、以中性粒細胞為主，C 反應蛋白≥20 mg/L，伴有可疑感染灶的相應癥狀和體征。排除標準：病毒或真菌等非細菌病原微生物引起的感染。

本研究獲得患兒家屬同意，并通過蘇州大學附屬兒童醫院倫理委員會批準（2021CS023）。

1.2 儀器和試劑

胰蛋白酶（Promega，美國）、尿素（Sigma，美國）、蛋白質濃度測定試劑盒（Abcam，英國）、超速離心機（Hitachi Himac，CP80WX，日本），高效液相色譜儀（Malvern， EASY-nLC 1200 System，英國）、納米顆粒跟蹤儀（Particle Metrix，ZetaView PMX 110，德國）、質譜儀（賽默飛QExactive HF-X，美國）。

1.3 外泌體的分離及鑒定

留取入組患兒入院次日空腹全血3 mL，離心獲得血清，取1～2 mL 血清樣本采用差速離心法獲取外泌體。提取樣本15 μL置于銅網靜置，隨后染色。電鏡觀察其形態，并用納米顆粒跟蹤技術（nanoparticle tracking analysis，NTA）分析血清外泌體的大小，驗證提取顆粒為外泌體。

1.4 外泌體蛋白的提取與酶解

樣本加入8 mol/L尿素、1%蛋白酶抑制劑，離心后提取上清液蛋白，測定蛋白濃度，加入適量標準蛋白，裂解液調整體積，加入二硫蘇糖醇，靜置30 min后加入碘乙酰胺，室溫孵育15 min。加入稀釋尿素、胰蛋白酶酶解，離心收集上清液。

1.5 液相色譜-質譜聯用分析

該技術用于特定蛋白的定量分析：將需檢測的肽段進行篩選，并對于進入質量分析器的所有離子進行掃描；肽段用液相色譜流動相A 液（0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液） 溶解后使用EASY-nLC1200 超高效液相系統進行分離。使用NSI 離子源、HF-X 質譜儀進行質譜分析。離子源電壓設置為2.1 kV。一級質譜掃描范圍為400～1 500 m/z，掃描分辨率120 000；二級質譜掃描固定起點為100 m/z，掃描分辨率15 000。使用數據依賴型掃描程序采集數據。自動增益控制設置為5×104，最大注入時間設置為50 ms，串聯質譜掃描的動態排除時間設置為30 s。

1.6 蛋白鑒定及定量分析

平 臺 Maxquant 1.5.2.8 （http://www.maxquant.org/）對質譜數據進行處理，并對蛋白質行定量分析，所得結果在Human UniProt/SwissProt 數據庫中查詢。本研究以P＜0.05，差異倍數＞1.5 或＜1/1.5 倍為標準篩選差異蛋白質。

1.7 生物信息學分析

通過Uniprot 的注解信息，對差異蛋白進行基因功能（gene ontology，GO）分析（包括生物過程、細胞組成、分子功能3 類）、kyotoencyclopedia of genes and genomes（KEGG）通路分析、蛋白質功能富集聚類分析。對互作關系緊密的差異蛋白繪制圖像。

1.8 統計學分析

采用SPSS 23 統計軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗；不符合正態分布計量資料采用中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料

除發熱時間外，兩組其他一般臨床資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 血清外泌體的分離及鑒定

電鏡圖像顯示外泌體呈類圓形的囊泡，可見外周膜性結構（圖1），NTA 技術驗證外泌體直徑為（140±6）nm，顆粒原始濃度為1.2×1010個顆粒/mL、密度為1.13～1.21 g/mL，NTA技術驗證提取物為外泌體。

圖1 外泌體囊泡在電鏡下的特點（×40 000）

2.3 蛋白質鑒定及定量結果

在本研究中一共定量到296個蛋白。進一步以差異倍數＞1.5、P＜0.05、至少含有2 條特異性肽段為條件篩選蛋白，共篩選出131種差異蛋白，其中27種蛋白為兩組共有。

48種蛋白僅在KD組中表達。以P＜0.05、差異倍數＞1.5 作為上調的閾值；P＜0.05、差異倍數＜1/1.5 作為下調的閾值進行篩選，其中上調23 種，下調25 種。通過靶向蛋白質組學技術平行反應監測（parallel reaction monitoring，PRM）技術驗證了6種KD組特有差異蛋白，見表2。

表2 KD組特有外泌體蛋白列表

29 種蛋白僅在感染對照組中表達，其中上調蛋白12 種，下調蛋白17 種，通過PRM 技術驗證4種特有差異蛋白，見表3。

表3 感染對照組特有外泌體蛋白列表

2.4 KD組差異蛋白GO分析

KD 組差異蛋白與生物調節、細胞進程、對刺激的反應等生物進程相關；與細胞及胞外區、細胞器等細胞組成密切相關；與分子綁定、催化調節、分子功能調節等分子功能相關，見圖2。

圖2 KD組外泌體差異蛋白GO分析

2.5 差異蛋白互作分析

KEGG 信號通路分析：KD 組差異蛋白主要在補體和凝血級聯反應、MAPK 信號途徑通路富集。亦參與百日咳、朊病毒疾病、南美洲錐蟲病、麻疹、沙門氏菌感染通路，查閱文獻未能找到蛋白參與這些通路的相關信息，故需待后續實驗進一步探究（圖3）。

圖3 KEGG信號通路聚類分析熱圖

從差異蛋白中篩選出互作關系最緊密的蛋白（按照Confidence score＞0.7 提取）繪制蛋白質互作網絡圖像。PRM驗證后KD組可定量6種特有蛋白，繪制蛋白質互作網絡圖像后示FGG及C1QC與其他蛋白互作關系緊密（圖4）。PRM 驗證后感染對照組可定量4種特有蛋白，繪制蛋白質互作網絡圖像后示VWF與其他蛋白互作關系緊密（圖5）。

圖4 KD組外泌體差異蛋白互作網絡圖

圖5 感染對照組外泌體差異蛋白互作網絡圖

3 討論

部分KD患兒缺乏典型臨床表現，僅以發熱為主要表現，在病程的初期這些患兒易被誤診成細菌感染性疾病，接受了不合適的抗感染治療，且延誤了診斷及使用丙種球蛋白的治療時間，故尋找可靠生物標志物協助診斷不完全KD 極為重要。外泌體由于具備囊泡結構穩定、內含蛋白種類數量可能與機體的疾病狀態相符等特質，成為當下學者研究的熱點［11］。

本研究將急性期KD患兒與細菌性感染疾病的患兒血清外泌體蛋白進行對比分析，在KD組找到48 個特有差異蛋白，并對其進行GO 分析、KEGG信號通路分析及蛋白互作網絡分析，以明確蛋白功能、參與的調節通路，并探索這些蛋白及參與通路在KD中的具體作用。此外，本研究亦對細菌性感染疾病患兒的血清外泌體蛋白進行了分析，以期為不明原因發熱的患兒提供早期診斷思路。

KD 組特有蛋白FGG、SERPING1 顯著上調。FGG 與FGA 和FGB 聚集后共同參與機體止血，顯著血小板計數升高是KD患兒伴發冠狀動脈損害的高危因素，血小板數量、活性增強均與KD轉歸有關［12］。KD亞急性期中，血小板釋放進入外周血中的數量增多加速了血栓形成［13-15］。繪制KD組特有蛋白PPI圖像后發現FGG與多種蛋白質間的作用緊密，處于圖像的核心位置，故本研究推測FGG 蛋白參與KD血小板升高的過程，并加重了血管炎癥反應，且誘發血栓形成，其有望成為補充KD診斷的生物標志物。

上調蛋白SERPING1 抑制C1 相關補體蛋白，由于其在蛋白互作網絡中的位置分布相較于FGG處于稍邊緣區，故推測其位于通路中的作用及功能略低于上調蛋白FGG，且與其互作蛋白種類及數量均少于FGG，故本研究認為SERPING1作為生物標志物補充診斷KD的可靠性低于FGG，這仍需要后續實驗進一步明確。

下調蛋白C1QC及C1QA均為組成C1Q的亞基，C1Q、C1R參與補體經典途徑。C1Q是補體經典途徑的始動分子，其來源豐富：肥大細胞、巨噬細胞、未成熟樹突狀細胞（immature DC，imDC）均能產生C1Q，imDC產生C1Q的數量高于其他細胞，它在機體受到病原體影響時分化為成熟DC且不再分泌C1Q［16-18］。本研究檢測C1QC 數量減少原因推測如下：一方面，在急性期KD患兒體內釋放細胞因子作用于imDC，使其分化成熟導致外周血中C1Q 生成量銳減；另一方面，急性期KD 患兒補體經典途徑激活大量消耗C1 相關蛋白，導致血液中C1Q 蛋白減少。C1QC 為C1Q 組成亞基，本研究中C1QC 的含量顯著減少，且下調蛋白C1QC 處于蛋白互作網絡中較為核心的位置，故本研究推測其在疾病早期診斷中存在一定的價值。

下調蛋白IGHG4 是由B 淋巴細胞分泌的糖蛋白，在體液免疫初期接觸特定抗原后，啟動B淋巴細胞的克隆擴張和分化漿細胞，并參與介導體液免疫的效應期［19］，我們推測其參與了補體經典途徑的激活。

KEGG 信號通路分析顯示KD 組外泌體蛋白主要在MAPK信號途徑、補體和凝血級聯反應通路中顯著富集。MAPK信號參與機體內細胞間應激與凋亡、炎癥調控等多種病理生理過程。有文獻報道MAPK 信號通路之一P38MAPK 對心肌肥大具有負向調節作用，且與急性心肌梗死后心肌缺損再灌注的過程相關［20］。在一項關于先天性心臟病發病的研究中發現，P38MAPK 通路下游效應基因MKNK2和ELK1表達抑制抵抗素通過MAPK信號通路上調MMP-9 mRNA 和蛋白分泌，致冠狀動脈內皮細胞損傷［21-22］，這一機制提示MAPK信號通路可能參與KD中冠狀動脈損傷過程。綜上所述，推測MAPK 信號通路及作用蛋白可能與KD 急性期心臟炎癥性反應及冠狀動脈損傷情況相關。

外泌體蛋白在“補體和凝血級聯反應”中顯著富集。由于FGG 參與凝血過程，而C1QC 作為C1 蛋白組成部分參與補體的經典過程，故2 條富集通路驗證了候選蛋白在疾病發生過程中的關鍵作用。

本研究驗證出4種僅在細菌性感染疾病患兒急性期血清中存在的外泌體蛋白，分別為VWF、ECM1、F13A1、TTR。其中上調蛋白VWF 通過在血管內皮下膠原基質與血小板表面受體復合物上形成分子橋梁，促進血小板與血管損傷部位的黏附，推測聯合檢測這些具有顯著特性的蛋白有助于早期鑒別發熱患兒的具體病因。

綜上，本研究推測KD患兒外泌體蛋白FGG及CIQC有望成為補充診斷KD的生物標志物，聯合檢測蛋白FGG、C1QC及VWF有助于早期鑒別發熱患兒的病因；KD 相關蛋白富集于通路MAPK 信號途徑及補體和凝血級聯反應，我們認為對通路及參與蛋白的分析有助于進一步了解KD的發病機制。