不同材料中紅曲霉的分離及對比研究

張敏星，周 游，許 玫，陳文品

（1.重慶三峽職業學院農林科技學院，重慶 404155；2.重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404120；3.華南農業大學 園藝學院，廣東 廣州 510642）

紅曲菌隸屬真菌界（Eumycophyta）、子囊菌門（Ascomycota）、真子囊菌綱（Euascomycetes）、散子囊菌目（Eurotiales）、紅曲菌科（Monascaceae）、紅曲屬（Monascus）[1]。紅曲霉是腐生真菌，生長的最適pH值為3.5～5.0，嗜乳酸，耐10%乙醇，生長溫度為26～42℃，最適溫度32～35℃。1979年，Akira Endo[2]從紅色紅曲霉（Monascus ruber）中分離出一種膽固醇合成抑制劑Monacolin K，即洛伐他汀，具有良好的血脂調解功能，被廣泛應用于高血脂癥的治療中。紅曲米是以大米為主要原料經紅曲菌發酵而成，在我國已有1 000多年的應用歷史，是紅曲霉菌種選育常見的分離材料[3]。

2003年，普洱茶中首次發現了有洛伐他汀的存在[4]，隨后還發現洛伐他汀是普洱茶中發現的唯一他汀類化合物[5]，此后陸續有報道在普洱茶中檢測到洛伐他汀，尤其是陳年普洱茶中，但并不是所有普洱茶中都存在[6-7]。普洱茶有減肥茶、美容茶、益壽茶等美稱，大量科學研究顯示普洱茶對人和動物具有降血脂功效[8-10]，相比綠茶、烏龍茶、紅茶等降脂功效更顯著[11-12]，可能與普洱茶中特有的降脂成分洛伐他汀有關[13]。近年來，國內外學者對普洱茶中產洛伐他汀微生物開展了研究[14-15]，但鮮有報道從普洱茶中分離到紅曲霉。

以紅曲米和普洱茶為原料，通過不同分離方法進行紅曲霉菌種的分離，目的是為了更好挖掘降脂紅曲霉種質資源，揭示降脂功能食物與紅曲霉之間的關系，為后續研究紅曲霉與洛伐他汀降脂普洱茶之間的關系提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌種分離材料

紅曲米：市售的2種紅曲米。

茶葉：4個不同發酵程度普洱熟茶、2個不同年份陳年普洱茶，共6個茶樣。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，切碎成丁，加水煮沸30 min，紗布濾渣，加無水葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，加熱攪拌，冷卻后定容至1 000 mL，高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20 min。

麥芽汁瓊脂培養基（MEA）：稱取麥芽粉，加4倍60℃的水，在65℃水浴中糖化3～4 h，糖化程度用碘液滴定（不變藍色即可），紗布過濾，濾液稀釋至約10 Brix，加入2%瓊脂，于121℃下滅菌20 min。

麥芽汁培養基（MA）：直接使用麥芽汁培養基藥品配制，即取130.1 g麥芽粉（含氯霉素），加水至1 000 mL，混勻，于121℃下滅菌20 min。

1.3 分離方法

點接法直接分離：在雙人雙面超凈工作臺上，將材料以三點法點接在PDA培養基和MEA培養基上進行菌種分離，操作完成后置于恒溫培養箱培養。

稀釋涂布平板法：分別取1 g材料，加入9 mL無菌水，然后依次稀釋至300倍、9 000倍、270 000倍的不同濃度，取0.2 mL涂布接種于MEA培養基上，每個濃度重復3皿。

選擇性平板分離法：用無菌水按1%冰醋酸和5%乙醇配制pH值為3的處理液，將分離材料于處理液中活化24 h，再涂布接種于PDA平板培養基上培養。

選擇性液體分離法：含10%的無水乙醇、pH值為3的麥芽汁培養基進行分離。

1.4 純化方法

待培養基中長出肉眼可見大小不同的菌落，采用菌絲頂端純化法，接種到PDA和MEA培養基上，繼續培養觀察，直到所見菌落形態可判定為同一種菌種。

1.5 鑒定方法

（1）菌落形態鑒定方法。將已分離的紅曲菌株采用3點法分別接種到MEA、PDA平板培養基上，25℃下培養7 d，觀察并記錄菌落特征。菌落形態特征包括菌落大小、顏色、質地、厚薄、紋飾、邊緣形態、滲出物及色素等。

（2）個體顯微形態鑒定。直接制片觀察法[16]，即從生長7 d的菌落上用鑷子挑取少量菌絲體，放在預先擦凈并滴有乳酸石炭酸-苯酚溶液或者蒸餾水的載玻片上，用解剖針和鑷子小心地將菌絲分散開來，蓋上潔凈蓋玻片，置于生物顯微鏡下觀察，并記錄觀察結果。個體顯微形態包括菌絲特征、閉囊殼特征、分生孢子形態特征等。

關于分離菌株在菌落形態和個體顯微形態的鑒定是否屬于紅曲霉屬，參考學者李忠慶等人[1，17]的分類鑒定標準。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉的分離

對紅曲霉進行分離時，分離方法采用材料點接法、稀釋涂布平板法和選擇性排他培養法，分離培養基采用半合成培養基（PDA、MEA）、加酸加醇的處理液和加酸加醇的麥芽汁液體培養基進行分離，最終從紅曲米中分離到9株紅曲霉，普洱茶中沒有分離到紅曲霉。

2.1.1 不同分離方法的分離效果

試驗結果表明，不同分離方法，尤其是培養條件不同，分離效果不同。試驗中，采用加酸加醇選擇性培養手段，創造適于紅曲霉生長的條件進行分離，效果最好，分離到的基本都是紅曲霉屬菌種。采用點接法及稀釋涂布平板法在半合成培養基上能分離到紅曲霉，但同時也分離出曲霉屬、青霉屬、酵母菌等其他微生物，進而影響到紅曲霉菌株后續的分離純化。

紅曲霉具有嗜酸耐乙醇的生長特性，但生長速度較緩慢，在平板分離純化中容易被其他絲狀真菌覆蓋而難以被分離純化出來，目前對可培養紅曲霉的分純方法有直接分離法和排他分離法[18]，總結紅曲霉分離純化的簡易方法，在培養條件中加入乳酸和酒精以抑制其他微生物生長，可達快速分離紅曲霉的目的[19]。

2.1.2 不同培養基的生長對比

在紅曲霉的分離及后期純化過程中，同種材料、同種紅曲霉菌株在不同培養基上生長表現不同。

紅曲霉在不同培養基上的生長表現見圖1。

圖1 紅曲霉在不同培養基上的生長表現

在PDA培養基上，紅曲霉生長明顯受到一定程度的限制，菌落直徑小、較薄，表面的菌絲短而稀疏，菌落背面分泌色素多為紅色或粉紅色物質。在MEA培養基上，紅曲霉生長旺盛，菌落直徑大、有一定厚度，表面菌絲密而長、多數呈絨毛狀，菌落背面分泌色素多為橙黃色物質。

2.2 紅曲霉的純化

在紅曲霉的分純過程中發現，其生長表現易受外界條件影響，同一菌株在相同培養基上培養相同時間，菌落形態特征存在差異。推測可能是紅曲霉純化接種操作過程中培養皿內氧氣含量不同而導致的，因此在試驗中選取了一株紅曲霉進行氧氣對生長表現影響的試驗。將紅曲霉菌株以三點法接種在MEA培養基中，保鮮膜包扎后于培養箱培養，3次重復。菌株培養7 d后，分別進行脫膜透氣處理和不脫膜處理。

氧氣對紅曲霉生長表現的影響見圖2。

圖2 氧氣對紅曲霉生長表現的影響

由圖2可知，接種7 d后（圖2（a）和（b）），可見菌落表面白色，氣絲密、絨毛狀；菌落背部橙黃，有一明顯橙色同心圈，邊緣氣絲長、淺黃色。7 d時，將其中一培養皿進行脫膜透氣處理，透氣處理后（圖2（c）和（d）），菌落長勢變化較大，表面氣絲在脫膜后生長旺盛，到14 d時略顯衰落，菌落背面橙紅，色素分泌明顯增多。未經脫膜透氣處理（圖2（e）和（f）），菌落生長緩慢，在培養至14 d時，其長勢相較透氣處理差異明顯，相較7 d時則變化差異不大。結果表明，紅曲霉在不同氧氣環境中生長表現不同，充足的氧氣環境有利于紅曲霉分泌色素物質，積累代謝產物。

此外，在紅曲霉的分純過程中還發現，紅曲霉受到青霉、曲霉、酵母等其他微生物污染時，接觸部位紅曲色素分泌量增多、差異顯著，且氣生菌絲較長。

其他微生物與紅曲霉共生時紅曲霉生長表現圖見圖3。

圖3 其他微生物與紅曲霉共生時紅曲霉生長表現圖

微生物的生長代謝受營養供給影響，當多種微生物共存時，會在營養、空氣等方面存在競爭或合作等交互關系，進而影響生長表現。由此可見，紅曲霉的生長代謝易受外界條件影響，如對紅曲霉的鑒定進行到具體菌種時，除了傳統的形態學鑒定，借助分子生物學鑒定顯得十分必要。

2.3 紅曲霉的鑒定

通過紅曲米和普洱茶中紅曲霉的分離純化及鑒定，最終共分離到9株紅曲霉。

不同紅曲菌在MEA斜面培養基上的菌落形態圖見圖4，不同紅曲霉的形態特征觀察記錄見表1。

表1 不同紅曲霉的形態特征觀察記錄

圖4 不同紅曲菌在MEA斜面培養基上的菌落形態圖

9株菌的菌落形態特征表現為菌落初期為白色，后期變為黃色、橙黃、粉色、橙紅色、紫紅色等，表面菌絲多為絨毛狀、多數密而長、少數較稀疏，多有顆粒狀物質，部分有水珠分泌，背部有規則或不規則輻射紋。9株菌的個體顯微形態特征表現為菌絲均有橫隔、透明而多核、少數菌絲較寬；都有閉囊殼結構；分生孢子多數單生、呈球形，也有2～6個向基式鏈狀著生的。對比這9株菌株的菌落形態和個體形態，符合紅曲霉屬分類標準中的形態特征，可確定為紅曲霉屬微生物。

2.4 2種材料分離結果的對比分析

2.4.1 紅曲米中紅曲霉的分離結果

試驗從紅曲米和普洱茶中分離紅曲霉，紅曲米中分離到9株紅曲霉，普洱茶中沒有分離到紅曲霉。紅曲米是以大米為主要原料經紅曲菌發酵而成，在我國已有1 000多年的應用歷史，性溫、味甘、無毒，具消食活血、健脾溫胃等功效，紅曲米的功效與紅曲霉密切相關[3]。目前，對紅曲霉菌種的選育，主要從紅曲發酵產品中獲得，多數分離材料是紅曲米[20-21]，也有從酒醅、紅腐乳、老陳醋中進行分離，結果都能分離到紅曲霉。因此，紅曲米成為諸多學者選育降脂紅曲霉最常見、分離效果最好的材料之一。試驗分離到9株紅曲霉，都來自紅曲米，也證實紅曲米確實是紅曲霉菌種選育的良好材料。

2.4.2 普洱茶中紅曲霉的分離結果

試驗中選用了6個普洱茶樣作分離材料，包括4個不同發酵程度普洱熟茶、2個不同年份陳年普洱茶（均為20年以上），共6個茶樣，都未分離到紅曲霉。根據前人對普洱茶中他汀類物質的研究可知，陳年普洱茶中有檢測到洛伐他汀，并不是所有普洱茶中都存在[6-7]。試驗選擇20年陳年普洱茶為分離材料，同時考慮到普洱熟茶中天然存在黑曲霉、青霉、根霉、酵母等優勢菌群可能會干擾紅曲霉的分離，采用直接分離和加酸甲醇選擇性分離法，都未分離到紅曲霉。

試驗結果表明，茶普洱茶中可能沒有紅曲霉存在或紅曲霉種類和數量極少，因此分離不到或較難分離到紅曲霉。

3 結論

紅曲霉具嗜酸耐乙醇的生長特性，在分離時可通過添加乳酸和酒精，有助于抑制其他微生物生長而達到快速分離紅曲霉的目的。紅曲霉在受到營養供給、氧氣供給及其他微生物等外界條件影響時，出現色素分泌增多、菌絲生長旺盛的表現，使得與純菌株時形態特征表現不同，因此對紅曲霉的鑒定到具體菌種時，借助分子生物學手段十分必要。

通過紅曲米和普洱茶對紅曲霉的分離純化及鑒定，試驗最終共分離到9株紅曲霉，其形態特征表現為菌落初期為白色，后期因分泌色素而變為黃色、橙、粉色、紫紅色等；個體顯微形態上菌絲均有橫隔，有閉囊殼結構，分生孢子多數單生、呈球形。

紅曲米中分離到9株紅曲霉，普洱茶中未分離到紅曲霉。結合前人研究結果可知，紅曲米是選育紅曲霉的良好材料，而普洱茶存在的洛伐他汀是否與紅曲霉有直接關系，還有待進一步研究。