經典Wnt信號通路在骨肉瘤中的作用機制

黃為，唐富平，李祖德，葉來生

(1.廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530001； 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腫瘤科，南寧 530011)

骨肉瘤是一種由間質細胞發展而來的惡性骨腫瘤，主要侵襲關節周圍，以脛骨近端和股骨遠端的長骨干骺端多見，其發病高峰年齡為15～19歲[1]。臨床上骨肉瘤發展以隱匿性、生長迅速、腫瘤細胞過度增殖以及較強的侵襲性和轉移性為主要特征，且能夠通過血行轉移到肺和胸膜[2]，嚴重危及患者的生命。目前骨肉瘤治療方法主要包括免疫治療(主動特異性免疫治療和非特異性免疫治療)、基因和手術治療等，聯合應用阿霉素、大劑量氨甲蝶呤、順鉑等化療藥物患者的5年生存率達60%～70%[3-4]，但藥物的毒性作用可導致患者耐受性差，甚至引起溶血、肝腎功能損害。因此，臨床缺乏治愈骨肉瘤的有效手段。近年研究發現，Wnt信號通路參與骨肉瘤的生長、增殖以及侵襲轉移，并能促使骨肉瘤的耐藥和再生，在骨肉瘤發生和發展過程中扮演重要角色[5]。

異常的Wnt信號通路能夠增強C-myc基因、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)等致癌基因的表達，從而誘導骨肉瘤的發生[6]。因此，充分了解Wnt信號通路在骨肉瘤中的作用機制，找出靶向治療骨肉瘤增殖和侵襲的手段和方法，可能成為抑制骨肉瘤發生、發展的關鍵?，F就經典Wnt信號通路在骨肉瘤發生發展、細胞凋亡、侵襲轉移等中的作用予以綜述。

1 經典Wnt信號通路的組成及機制概述

Wnt信號通路是一條高度保守的生長因子家族信號通路，是細胞間信號轉導的關鍵通路之一。它分為4個不同的通路，分別為Wnt/β聯蛋白(β-catenin)通路、Wnt/Ca2+通路、Wnt/平面細胞極性通路及Wnt/蛋白激酶A通路[7]，而經典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin通路是目前研究最廣泛、最重要的Wnt信號通路，它通過調節β-catenin驅動靶基因的激活，并調節多種生物的生長發育過程。

目前認為，經典Wnt信號通路通常由以下幾種成分組成：Wnt蛋白(Wnt配體)、Wnt受體蛋白[卷曲蛋白(Frizzled，FZD)家族及低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor related protein，LRP)]、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、酪蛋白激酶 1、DvL(Dishevelled)蛋白、β-catenin、T細胞因子、淋巴增強因子家族及其下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、Survivin等)。另外，經典Wnt信號通路的作用機制為在存在合適Wnt配體的情況下，Wnt與FZD家族的7種跨膜受體和LRP5/6結合形成三聚體，使細胞內DvL蛋白激活，DvL蛋白的激活導致GSK-3β的抑制，從而使β-catenin不被GSK-3β磷酸化，β-catenin在細胞質內大量積聚并促進其向細胞核轉運，β-catenin作為整條信號通路的關鍵樞紐分子，在細胞核內與T細胞因子/淋巴增強因子形成復合體，引起下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、Survivin等)的轉錄，進而導致細胞的異常增殖及組織分化，誘導腫瘤形成[8](圖1)。

注：Frizzled為卷曲蛋白，LRP5/6為低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6，DvL為Dishevelled，GSK-3β為糖原合成酶激酶-3β，CyclinD1為細胞周期蛋白D1，β-catenin為β聯蛋白，TCF為T細胞因子，LEF為淋巴增強因子

Wnt信號通路具有調控腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡及侵襲等生物學功能。研究證實，Wnt/β-catenin通路與骨肉瘤的發生發展密切相關[9]。同時有研究表明，Wnt/β-catenin通路的異常激活與肺癌、乳腺癌、結腸癌、鼻咽癌等有關[10-11]。

2 經典Wnt信號通路與骨肉瘤的發生發展

2.1Wnt蛋白與骨肉瘤的發生發展 Wnt是一種分泌型糖蛋白，具有分泌的N端信號肽，并在調節發育過程和成人組織穩態中起重要作用。其Wnt配體是獨特的，可以激活不同受體介導的信號轉導通路。目前發現19種Wnt蛋白中至少有7種(Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt8和Wnt10b)在Wnt/β-catenin信號通路中發揮作用[12]。此外，在骨肉瘤細胞株中發現了Wnt1、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a和Wnt14蛋白的存在；在Wnt相關基因中，4個細胞株中有2個細胞株表達高度轉化的Wnt1，3/4的細胞株表達Wnt4，而所有細胞株均表達弱轉化的Wnt5a和Wnt7a[13]，因此Wnt配體蛋白與骨肉瘤的發生發展有密切聯系。

目前，已證實兩種人骨肉瘤細胞中存在多個Wnt配體(即Wnt2b、Wnt3、Wnt5a和Wnt14)和受體(即FZD1、FZD2、FZD3、FZD6、FZD7、LRP5和LRP6)的表達。此外，Chen等[14]在44例骨肉瘤樣本中發現，至少有75%的骨肉瘤患者存在Wnt10b表達，患者生存率呈顯著降低趨勢。以上研究證實，Wnt蛋白與骨肉瘤密切相關，因此通過靶向干預上游Wnt蛋白，阻斷β-catenin信號通路相關因子傳入下游，可能有利于防止骨肉瘤的發生。

2.2β-catenin與骨肉瘤 β-catenin作為經典Wnt信號通路中實現細胞核內外信號轉導的關鍵信號因子，通常在細胞中保持低水平狀態。目前發現其在細胞的增殖、分化和凋亡等方面起重要的調節作用[15]。Wnt信號通路的異常激活會導致復合體破壞，使細胞中上皮鈣黏素的表達水平下降，進而調節波形蛋白促進移動蛋白上調，造成細胞失去極性，細胞間的連接變得疏松，導致通路中的細胞黏附力下降，從而影響骨肉瘤的轉移及發生發展[16]。Xu等[17]的研究表明，骨髓間充質干細胞中的短鏈脫氫還原酶12抗體可以與β-catenin形成復合物，從而穩定細胞表面的β-catenin，導致Wnt信號通路失活，進一步抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移與侵襲，誘導骨肉瘤的凋亡。Liu等[18]研究證明，細胞增殖上調因子4與腫瘤發展和臨床分型密切相關，其在骨肉瘤細胞中高表達，通過GSK-3β/β-catenin/CyclinD1通路調節細胞周期，從而影響骨肉瘤細胞的增殖。因此β-catenin是該通路影響細胞分化功能的重要中間環節，然而目前部分研究仍停留在初級理論階段，需要更多的研究證實。

2.3LRP5/6與骨肉瘤 LRP5及其密切相關同源物LRP6是介導Wnt/β-catenin通路的兩個重要分子，目前已有研究表明兩者與原發性骨肉瘤的發生發展密切相關[19]。

FZD與LRP5/6作為Wnt蛋白的共受體，可以被來自Dkk(Dickkopf)家族的分泌蛋白拮抗，然后分泌蛋白與LRP5或LRP6以高親和力結合，從而抑制Wnt信號通路相關因子，起到抑制腫瘤發生發展的作用[20]。Guo等[21]在實驗中發現，可溶性顯性陰性LRP5阻斷了骨肉瘤細胞中的經典Wnt信號通路，并抑制Met和基質金屬蛋白酶等癌癥相關標志物，從而降低骨肉瘤的致瘤性和轉移性。Yang等[22]將LRP6過表達載體轉導到骨肉瘤細胞(MG63)中，發現LRP6的過表達消除了微RNA(microRNA，miRNA/miR)-183誘導的Wnt/β-catenin通路失活，從而抑制骨肉瘤細胞上皮-間充質轉化，最終阻止骨肉瘤細胞的生長、侵襲，減少骨肉瘤的發生。因此靶向干預 Wnt蛋白、LRP5/6等上游的相關靶基因，可能是治療骨肉瘤的一種潛在有效方法。雖然目前有研究對通過經典Wnt信號通路治療骨肉瘤進行了探討，但缺少有價值的數據驗證，未來仍需大量證據證實經典Wnt信號通路中FZD、LRP5/6對骨肉瘤發生發展的影響。

3 經典Wnt信號通路與骨肉瘤細胞凋亡

細胞凋亡是由基因控制的細胞發生有序的自我消亡，在維持內環境穩定、正常生長發育、細胞分化等過程中起重要作用。近年研究證實，經典Wnt信號通路與骨肉瘤細胞的形成、遷移和凋亡密切相關[23-24]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，具有腫瘤特異性，與腫瘤細胞的分化、增殖及侵襲轉移密切相關[25]。Survivin蛋白通過抑制胱天蛋白酶(caspase) 3和caspase-7的活性，從而起到抑制細胞凋亡的作用[26]。同時，Survivin也通過P21蛋白間接抑制caspase。在細胞增殖分化的誘導下，Survivin表達明顯增強，其與細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)結合形成Survivin-CDK4復合物，使P21蛋白從Survivin-CDK4復合物中釋放出來，并引導其與線粒體caspase-3前體結合，致使caspase-3活性降低，從而進一步阻止線粒體釋放細胞色素C，最終抑制細胞凋亡[27]。另外，Survivin也是經典Wnt信號通路的下游靶基因，β-catenin在腫瘤細胞中的表達顯著增加，可以使Survivin表達水平升高[28]，同時Survivin與β-catenin可能共同作用于Wnt/β-catenin信號通路來影響腫瘤的轉化過程，并促進細胞增殖，進而發揮抑制細胞凋亡的作用(圖2)。Tan等[29]在骨肉瘤細胞實驗模型中發現，二氫丹參酮Ⅰ能使骨肉瘤細胞中caspase-3蛋白表達水平明顯上調，而β-catenin和c-Myc蛋白表達水平明顯下調，從而抑制Wnt信號轉導通路，減少骨肉瘤細胞增殖并誘導其凋亡，最終減少骨肉瘤的發生。黃華坤等[30]研究發現，穿心蓮內酯可通過抑制Wnt信號通路的活性，使β-catenin和c-Myc表達水平均明顯下調，且凋亡相關蛋白caspase-3水平下降而抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高，進而抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲并促進其凋亡。以上研究均表明，Survivin、caspase、c-Myc等在維持正常的細胞分化功能中發揮重要作用，同時在骨肉瘤發生、發展的過程中也起著直接或間接作用。由此認為，針對Survivin、caspase、c-Myc等因子的靶向治療藥物是骨肉瘤治療的新途徑，其相關作用機制應進行深入探討。

注：β-catenin為β聯蛋白，caspase為胱天蛋白酶，CDK4為細胞周期蛋白依賴性激酶4，pro為前體

4 經典Wnt信號通路與骨肉瘤的耐藥性

近年來，隨著醫療和分子生物技術的進步，骨肉瘤的診斷和治療取得了很大進展，但多藥耐藥仍是該病進一步惡化的主要因素[31]。多藥耐藥是指腫瘤細胞對相關化療藥物產生耐藥性的同時，對其他未接觸過且結構和功能不相同的藥物也會產生一定的耐藥性[32]。因此，如果能夠明確化療藥物的作用機制，將有利于提高骨肉瘤耐藥患者的靶向治療效果。

已有研究表明，經典Wnt信號通路主要通過加快骨肉瘤細胞的增殖、分化、侵襲與轉移等誘導骨肉瘤多藥耐藥的產生[33]。此外β-catenin作為Wnt信號通路的核心蛋白，當Wnt信號通路被異常激活時，β-catenin在胞質中的活性持續升高，導致其向細胞核內轉移，并與核內T細胞因子/淋巴增強因子結合，進而激活相關耐藥基因(包括c-Myc、CyclinD1等)的表達[34]，最終造成細胞的異常增殖分化(圖3)。因此認為，通過靶向抑制Wnt信號通路可減少腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲，從而防止骨肉瘤多藥耐藥的發生。

注：β-catenin為β聯蛋白，CyclinD1為細胞周期蛋白D1，TCF為T細胞因子，LEF為淋巴增強因子

Zhang等[35]研究發現，circ_001569的敲除顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖能力，而上調circ_001569能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進骨肉瘤細胞對順鉑的耐藥性。Martins-Neves等[36]研究表明，化療藥物可顯著增強骨肉瘤細胞內Wnt/β-catenin信號通路的轉導活性，上調耐藥蛋白ATP結合盒亞家族G成員2的表達，從而使化療失敗，并增強細胞內干細胞轉錄因子的表達，賦予其腫瘤干細胞的特征。綜上可知，Wnt/β-catenin信號通路與骨肉瘤的發生、發展和藥物化療效應有密切聯系，它可以促進骨肉瘤細胞增殖、遷移以及化療耐藥性。但目前沒有足夠的證據支持Wnt/β-catenin信號通路治療骨肉瘤的作用機制，需要更多的實驗數據及臨床證據證實。

5 經典Wnt信號通路與骨肉瘤侵襲轉移

癌癥轉移是腫瘤進一步發展的關鍵因素，也是導致癌癥患者死亡的重要原因之一。骨肉瘤具有高度的局部侵襲和遠處轉移傾向，其轉移主要發生在肺部和骨骼[37]，據報道早期肺轉移患者的5年生存率僅為20%左右[38]。在經典Wnt信號通路中，β-catenin作為關鍵的調控因子廣泛存在于細胞質及細胞膜上，β-catenin磷酸化后可被泛素化，同時可通過蛋白酶進行降解，從而使β-catenin的表達活性降低，阻止下游靶基因的轉錄。當細胞外有Wnt受體時，被β-catenin磷酸化的Axin復合體穩定性下降，進而導致β-catenin磷酸化受到明顯抑制并在體內不斷集聚增殖，最終造成目標基因轉錄。因此Wnt信號通路加快了大多數癌癥的發生發展，有研究證實β-catenin的表達活性與腫瘤的浸潤發展、淋巴結的遠處轉移、腫瘤細胞的分化、惡變程度等呈正相關[39]。

裸露角質蛋白同源物2是Wnt/β-catenin信號通路的調節因子，其上調降低了骨肉瘤細胞在體外的遷移和侵襲能力，并抑制體內的腫瘤轉移[40]。此外在腫瘤異種移植模型實驗中發現，敲除HOXB8有效降低了骨肉瘤細胞中β-catenin、CyclinD1和c-Myc的表達水平，從而抑制Wnt信號通路，進而減少骨肉瘤細胞的增殖、遷移與侵襲[41]；Jin等[42]研究表明，miR-135b通過骨肉瘤細胞中的TET3、CK1A和GSK-3β來激活Notch和Wnt信號通路，同時抑制這些信號網絡的多個負調節因子，進而刺激骨肉瘤細胞的肺轉移、復發和干細胞發展。而拮抗miR-135b可導致Wnt和Notch信號同時失活，并對轉移、腫瘤干細胞誘導的腫瘤發生和異種移植模型中骨肉瘤的復發產生顯著抑制作用?？傊?，基于Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤中的作用機制，通過靶向抑制Wnt信號通路，對骨肉瘤的防治具有重要的臨床意義。

6 小結與展望

Wnt信號通路在骨肉瘤中的作用機制是骨科領域研究常見的問題之一，其機制尚不明確。經典Wnt信號通路在骨肉瘤細胞的凋亡、侵襲轉移以及化療耐藥性等方面均起重要的調控作用，且Wnt信號通路中的相關蛋白(包括Wnt蛋白、LRP5/6、β-catenin等)與骨肉瘤的發生發展有密切聯系。

通過靶向干預經典Wnt信號通路的相關靶點來調節其信號通路，從而改變通路中蛋白水平的表達，最終影響Wnt信號通路調控的生物學效應，為骨肉瘤的靶向治療提供了新的理論研究方向。截至目前，關于骨肉瘤的發病機制尚不清楚，仍有許多具體調控機制處于實驗和探索階段。如Wnt信號通路中分子調控機制與骨肉瘤細胞之間的關系還需進一步探索；非經典Wnt信號通路在骨肉瘤中的作用還不夠明確，也未得到充分的證實。此外，Wnt信號通路可調控骨髓間充質干細胞的分化表達，促進骨形成，而對Wnt信號通路的抑制是否會引起骨丟失、脆性骨折也需要進一步的研究。由于骨肉瘤的發病機制復雜多樣，未來的研究中應繼續深入闡明Wnt信號通路對骨肉瘤發生發展的具體機制，以為臨床治療骨肉瘤提供可行性方案。