內質網應激介導的細胞凋亡在糖尿病周圍神經病變中的機制研究進展

徐利娟，馬麗

(新疆醫科大學附屬中醫醫院內分泌科，烏魯木齊 830000)

隨著現代經濟的發展和人們物質消費觀念的變化，糖尿病的患病率不斷升高，患病群體逐漸低齡化。目前我國2型糖尿病患病率較高，糖尿病患者約1.5億，18歲以上人群糖尿病患病率為11.2%[1-2]，糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的并發癥，約50%的糖尿病患者并發DPN[3]，主要是感覺神經病變，伴自主神經病變，隨著疾病的進展，常有運動神經病變的特征[4]，表現為痛覺過敏、感覺異常等[5]。DPN的發病機制復雜，目前確切的發病機制尚不完全清楚，相關研究主要集中在醛糖還原酶活性增加、晚期糖基化/糖氧化、氧化硝化應激、蛋白激酶C、12/15脂氧合酶和受損的神經營養支持等方面[6]。

DPN機制復雜，目前尚無有效的DPN治療方法。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作為細胞蛋白質的質量控制系統，參與蛋白質的合成、折疊和運輸，并且作為細胞內鈣儲存和細胞應激的傳感器，在慢性炎癥、應激、高糖等狀態下，ERS反應和未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)激活，通過降低細胞內分泌蛋白的負荷增強蛋白質折疊能力或啟動不能恢復的細胞凋亡，以維持細胞內的蛋白質穩定，目前認為ERS是誘導細胞發生凋亡的關鍵。DPN的發病機制眾多，其中高血糖是DPN發生發展的主要原因[7]。近年發現，ERS在DPN發病過程中起重要作用[6]。現對ERS介導的細胞凋亡在DPN發病機制中的研究進展予以綜述。

1 ERS介導的細胞凋亡

DPN的發生發展與ERS誘導的細胞凋亡密切相關[8]。細胞內1/3的蛋白質合成、折疊和結構成熟均發生在內質網，幾乎所有內質網、高爾基體和溶酶體中的蛋白質都在內質網膜結合的核糖體上翻譯并注入內質網腔。內質網是由一層單位膜形成的囊狀、泡狀和管狀結構，分布在細胞質內側，不僅能保證細胞內鈣和脂質的穩態，還具有胞內物質轉運功能，其中包括分泌蛋白的折疊。靶向內質網的蛋白質有一個N端信號序列，該蛋白質首先在核糖體上合成，進而N端信號序列將其導向內質網膜。這些蛋白質通過轉座子復合體進行共翻譯，當翻譯完成時，蛋白質上的信號序列被蛋白酶去除進入內質網腔，并且折疊成獨特的三維形狀，并經歷各種翻譯后修飾，包括糖基化和二硫鍵的形成[9]，上述過程都需要不同酶的催化，同時內質網的穩態也有賴于其內部富含的多種酶，包括伴侶酶、糖基化酶等。正確折疊的蛋白質通過分泌途徑輸出，而不正確折疊的蛋白質在內質網相關降解過程中被特定的蛋白酶體降解。影響內質網穩態的生理、化學和病理因素均可導致其正常穩態被打破，引發ERS，為了應對這種情況，細胞激活適應性信號通路——UPR通過翻譯后、翻譯、轉錄后和轉錄機制進行轉導[10]，并通過促進蛋白質折疊、減少蛋白質翻譯和促進蛋白質降解恢復內質網穩態，這是細胞在壓力條件下所產生的自我保護與生存的功能，在輕度ERS下，蛋白質折疊能力和細胞存活恢復，但持續的不可溶解的UPR激活可通過觸發凋亡程序消除應激細胞[11]。

每個胰島β細胞每分鐘能合成和分泌100萬個胰島素分子，在胰島素抵抗狀態下，這種蛋白質合成負荷更大。發生糖尿病時，機體細胞處于高糖狀態，這種高糖狀態將會對細胞的代謝途徑產生影響，出于自我保護機制，細胞會自行啟動UPR，然而持續的高糖狀態可導致UPR觸發細胞凋亡。文獻指出，在機體自身生理條件下，葡萄糖調節蛋白(glucose-regulated protein，GRP)78與蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、激活轉錄因子(activating transcription factor，ATF)6以及肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)[12]的調節管腔結構域結合，使其處于非活性狀態。發生UPR時，未折疊或錯誤折疊的蛋白質競爭與GRP78結合，導致GRP78分別與PERK、ATF6、IRE1分離，其下游通路分別被激活[13]。通過PERK-真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)2α-ATF4、IRE1-c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/胱天蛋白酶(caspase)12 和ATF6信號途徑的激活導致C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)增多，使促凋亡和抗凋亡蛋白的表達分別形成正負調節趨勢，caspase家族蛋白表達增多，促使細胞發生凋亡。研究表明，注射ERS誘導劑衣霉素健康大鼠后肢出現明顯疼痛、持續熱反應喪失，且觸覺刺激異常敏感，類似于嚙齒動物DPN的行為特征；進一步實驗發現，服用ERS抑制劑4-苯基丁酸數分鐘內糖尿病大鼠的縮足時間即改善，抗傷害作用呈劑量和時間依賴性，與局部給藥相比，全身給藥的效果改善更確切，表明高血糖介導的ERS發生在外周神經中，對DPN的發生起促進作用[14]。在高血糖狀態下，抑制ERS能夠明顯改善運動神經及感覺神經傳導速度，減輕小的感覺神經纖維功能障礙和變性。口服鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型的坐骨神經中GRP78表達降低，神經傳導速度及其對機械和熱刺激的行為反應改善，與野生型小鼠相比，注射鏈脲佐菌素C57B6 CHOP-/-小鼠的神經功能改善更明顯，GRP78表達增加，進一步說明ERS在DPN發生、發展中具有不可忽視的作用[15]。

2 ERS信號通路在DPN中介導的細胞凋亡

2.1PERK-eIF2α-ATF4信號通路 PERK是一種Ⅰ型跨膜蛋白，當細胞處于應激狀態，PERK與GRP78解離后形成二聚體并發生自身磷酸化，自身磷酸化的PERK可使eIF2α發生磷酸化，進而阻斷eIF2α循環，同時抑制蛋白質合成所需的eIF2β鳥嘌呤核苷酸的交換活性，磷酸化的eIF2α可選擇性地誘導ATF4信使PNA(messenger RNA，mRNA)轉錄，轉運到細胞核上的ATF4可減弱整體翻譯并減少內質網腔蛋白負荷，恢復內質網穩態所需的蛋白質和伴侶的表達[16]，當細胞持續處于高糖狀態時，其ERS持續被激活，ATF4持續過表達則會激活CHOP等基因的表達，CHOP是ERS誘導細胞凋亡最重要的標志蛋白，在正常細胞穩態過程中普遍低表達，而持續的ERS導致CHOP高表達。PERK-eIF2α-ATF4信號通路是CHOP蛋白表達所必需的信號通路[17]；長期應激使細胞核內CHOP過量表達聚集，不僅能降低抗凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病-2的表達，加速細胞凋亡的發生[18-19]，而且能增加凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白從胞質轉運至線粒體，從而激活caspase-3，導致細胞凋亡[20]。

PERK在糖代謝中有重要作用，研究表明，攜帶肝細胞特異性PERK缺失基因小鼠在其他代謝異常中表現出糖異生缺陷[21]。此外，Wolcott-Rallison綜合征是一種罕見的常染色體隱性疾病，被稱為人類糖尿病綜合征，以PERK基因編碼突變為特征，臨床表現為2型糖尿病、骨質疏松癥等，患者可出現多發性骨骺發育不良、生長遲緩等癥狀[22]。高糖狀態下，高脂飲食聯合鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病小鼠模型的PERK磷酸化水平顯著升高，葡萄糖刺激的胰島素分泌以及細胞內Ca2+轉運均受到抑制，給予PERK抑制劑后，PERK磷酸化水平降低40%，葡萄糖刺激的胰島素分泌和胞質鈣水平明顯恢復，血糖降低，其血糖降低程度與每日服用10 mg格列美脲的效果相似，說明PERK通路對2型糖尿病所致高血糖有一定作用[23]。

蛋白質二硫化物異構酶A6與PERK相互作用可抑制其蛋白反應，而在正常或高糖刺激下，沉默蛋白質二硫化物異構酶A6表達小鼠的胰島素表達降低，表明PERK通路對糖尿病及DPN進程均有影響[24]。早期的報道表明，PERK抑制劑可防止神經退行性變，與正常大鼠相比，DPN大鼠模型坐骨神經及脊髓中的PERK水平分別增加32%和37%，磷酸化的eIF2α增加27%，CHOP水平增加18%，同時DPN大鼠出現一系列周圍神經系統癥狀與體征[15]。研究表明，在DPN大鼠鞘內注射CHOP干擾小RNA后，DPN大鼠L4～5腰椎脊髓中PERK-ATF4-CHOP通路相關促細胞凋亡因子mRNA水平較前顯著降低，大鼠周圍神經脫髓鞘現象相應改善[25]。在高糖暴露下，DPN大鼠坐骨神經和施萬細胞中CHOP、caspase-3和B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白/B細胞淋巴瘤/白血病-2水平均顯著升高，表明ERS參與高糖狀態下DPN的發生發展[26]。

2.2IRE1信號通路 IRE1是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由一個N端管腔感受器結構域、一個跨膜結構域和一個C端胞質效應區組成[27]，其管腔結構域可感知錯誤折疊的蛋白質，ERS持續的時間與程度決定細胞是否發生凋亡。在持續的ERS作用下，游離IRE1α通過寡聚和反式磷酸化的方式被激活，進而激活X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)mRNA，并通過轉錄因子XBP1 mRNA的切割誘導XBP1的下游表達，最終激活下游凋亡蛋白CHOP[28]；除剪接XBP1 mRNA外，IRE1α活化后關聯腫瘤壞死因子受體相關因子2和凋亡信號調節激酶1觸發細胞死亡。IRE1α寡聚化能誘導許多促炎和促死亡蛋白的激活或上調，在ERS過程中，腫瘤壞死因子受體相關因子2、caspase-12和凋亡信號調節激酶1被招募到IRE1α的激酶結構域，JNK表達增加進而激活caspase-3表達，同時IRE1α與多種促凋亡蛋白形成大分子信號復合物[29]，促進促凋亡環境的建立，從而誘導細胞凋亡的發生。在持續高糖作用下，IRE1α通路的作用甚至強于PERK信號通路，IRE1被持續高血糖或化學ERS源(如三酰甘油)激活，通過調節IRE1依賴性衰減活性降解胰島素mRNA，從而導致胰島素原減少，缺乏IRE1α-XBP1小鼠表現出多種代謝異常，代謝異常的類型取決于所涉及的細胞類型。肝細胞特異性缺失XBP1小鼠出現胰島素抵抗，胰島β細胞IRE1α-XBP1途徑的缺失導致嚴重的細胞功能障礙，包括胰島素分泌減少，導致細胞胰島素及胰島素原水平降低，胰島素原的氧化折疊減少[30]。IRE1α對高血糖的高敏感性提示其在DPN誘導的細胞凋亡中起重要作用[31]。研究表明，鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病大鼠后爪及坐骨神經中IRE1α的磷酸化水平升高，導致XBP1的總蛋白和mRNA水平以及GRP78水平顯著升高。同樣，p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和JNK1/2的磷酸化水平顯著增加[14]。而敲除IRE1α基因或其抑制劑已用于干預糖尿病及其他代謝紊亂。實驗研究表明，鞘內注射IRE1α干擾小RNA可使DPN大鼠和離體施萬細胞的凋亡分別減少77%和65%，在體實驗表明，抑制IRE1α可有效改善坐骨神經脫髓鞘病變，增加表皮神經纖維密度，提高運動、感覺神經傳導速度。體外實驗表明，轉染IRE1α干擾小RNA可抑制施萬細胞凋亡，這可能與DPN過程中IRE1通路中的相關凋亡蛋白CHOP和磷酸化JNK的下調有關[18]。用于治療DPN的中藥復方制劑糖絡寧的含藥血清已被證實可降低磷酸化的IRE1α/IRE1α和XBP1的表達，體外實驗證實，高糖環境下，糖絡寧干預的細胞內質網完整性較好，細胞凋亡數量減少[11]。

2.3ATF6信號通路 在ERS狀態下，GRP78的解離導致PERK和IRE1發生寡聚和自磷酸化，而ATF6的激活則與其不同，當ATF6與GRP78分離后，ATF6從內質網轉運到高爾基體，進而被兩種絲氨酸蛋白酶(S1P和S2P)切割，切割后的片段轉運入胞核，誘導GRP78、GRP94和內質網蛋白57等伴侶蛋白的轉錄[32]，增強內質網的蛋白折疊能力；此外，ATF6還可促進內質網相關蛋白的降解[33]。ATF6 信號通路對預防糖尿病小鼠胰島β細胞的丟失至關重要，同時對維持DPN神經細胞的穩態發揮重要作用。高脂飲食以及過度或不足的運動可以激活骨骼肌中的ERS，而反復適度的耐力運動可減弱與內質網相關的各種伴侶分子激活，從而保護骨骼肌細胞。研究表明，糖尿病小鼠骨骼肌中ATF6的表達顯著增加，游泳可以減少ATF6的表達，表明糖尿病激活了ERS，而游泳通過減少骨骼肌中ATF6的表達減弱ERS[34]。實驗研究表明，在胰島素抵抗以及糖尿病發生發展過程，ERS也作為主要機制參與其中，在慢性高血糖狀態下，ERS是導致胰島β細胞發生細胞凋亡的主要因素，進而降低胰島素攝糖及耗糖能力。二甲雙胍是經典的降糖藥物，可提高糖尿病大鼠的胰島素攝糖及耗糖能力，其作用機制為下調ATF6，改善大鼠ERS[35]，說明ATF6信號通路在糖尿病進展過程中起重要作用。在小鼠DPN模型中，XBP1的核易位受損可加重DPN，并與轉錄因子ATF6和CHOP水平增加有關[36]。

3 小 結

內質網與細胞的所有關鍵部分均存在密切的物理和功能聯系，因此內質網是協調體內代謝平衡和內外應激反應的中心平臺，慢性ERS引起的細胞損傷正成為糖尿病、神經退行性變、卒中和癌癥等廣泛流行的人類疾病的病理生理學核心。鑒于全球超重和肥胖的流行，了解內質網代謝適應的基礎生物學可能為代謝紊亂提供新的治療方法。ERS及其直接參與的細胞凋亡過程均為DPN患者以及動物模型DPN演變進程的重要環節，基于機制的治療方法可以預防這種損傷級聯并有效改善DPN的癥狀和體征，研發能夠調節ERS相關分子的藥物，可能為DPN的治療提供新思路。一些天然化合物有助于內質網受體功能機制的研究，但藥理學上，上述物質在人類疾病治療中的應用仍面臨較大挑戰，包括ERS操作的多效性、化合物藥理學靶向可能導致的非靶向不良反應等，但結合目前相關的科研學術成果推測，針對ERS途徑的干預措施以及增強內質網功能是未來探索DPN治療方法的新方向。