基于網絡藥理學聯合分子對接技術探討腎疏寧防治腎間質纖維化的作用機制*

于雯雯，秦蘇楊，王耀光

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

慢性腎臟病（CKD）現今已成為一種嚴重危害人類生命健康的慢性疾病。腎間質纖維化（RIF）是各種CKD發展至終末期腎病的共同通路，是CKD的主要病理表現[1]。近年來，隨著肥胖、糖尿病、高血壓的增多[2]，CKD的發病率也普遍上升[3]，RIF人數也隨之增長。多項研究發現，延緩RIF進展可有效保護尚未損壞的腎功能，對CKD的治療有重要意義。

中醫藥在治療腎臟病中積累了豐富經驗。腎疏寧是黃文政教授以“疏利少陽三焦”為主要治則，經天津中醫藥大學第一附屬醫院腎病科多年臨床實踐研究，篩選組合而創的中藥復方[4]，由柴胡，黃芪，黃芩，丹參，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草組成。現代藥理研究[5-6]發現，腎疏寧能改善腎小球系膜功能和腎小管的通透性，優化蛋白質的代謝[7]。王耀光教授臨床實踐[8]證明腎疏寧方能明顯改善患者的臨床癥狀、部分肝腎功能指標，并能減少尿蛋白，對CKD有一定療效。

網絡藥理學通過網絡和軟件分析來預測中藥的作用機制，為中醫藥研究提供了一種新的思維方式，使中藥多成分、多靶點的治療特點在臨床治療中能充分發揮其優勢[9]。本文基于網絡藥理學，結合分子對接技術，以分析腎間質纖維化高度相關的信號通路為主，探討腎疏寧防治腎間質纖維化的機制，以期為臨床運用提供參考。

1 材料與方法

1.1 腎疏寧相關靶點篩選 借助中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索腎疏寧中（柴胡，黃芪，黃芩，丹參，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草）9味中藥的化學成分[10]，TCMSP數據庫設定口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，初步篩選出活性成分及作用靶點，并根據相關文獻進行補充。借助Uniprot蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org）將化合物的蛋白質靶點與其基因名進行對應匹配；建立腎疏寧化學成分-靶點數據庫。

1.2 腎疏寧防治腎間質纖維化相關靶點篩選 通過檢索 GeneCards 數據庫（https：//www．genecards．org）、藥物靶標數據庫（TTD，http：//bidd．nus．edu．sg/group/cjttd）、在線《人類孟德爾遺傳》數據庫（OMIM，https：//www．omim．org），以“Renal Interstitial Fibrosis”為關鍵詞，檢索出防治疾病的潛在靶點。合并所有疾病數據庫靶點刪除重復值得到最終疾病相關靶點，將兩者靶點進行映射并繪制韋恩圖。

1.3 腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點網絡圖的構建 運用CytoScape3．8．0構建腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點網絡圖，并分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）及緊密度（Closenesss Centrality）等，最后根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

1.4 腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點PPI網絡構建 為了找出藥物與疾病靶點間的相互作用關系，將兩者交集靶點進行互作分析，利用Cytoscape3．8．0軟件構建PPI網絡并進行可視化呈現。

1.5 腎疏寧成分-腎間質纖維化功能與通路的富集分析 將腎疏寧防治RIF的靶點錄入DAVID Bioinformatics Resources 6．8 平臺，設定 P＜0．05，進行基因本體論（GO）生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，根據P值FDR值大小排序，并選取排名高的信號通路通過在線繪圖網站bioinformatics（http：//www．bioinformatics．com．cn）將其結果進行可視化呈現；并構建腎疏寧防治腎間質纖維化的靶點-通路網絡圖。

1.6 腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點的分子對接 將腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點網絡圖中度值，介度，緊密度高的活性成分通過ZINC（http：//zinc．docking．org）網站查找其3D結構。將PPI網絡中度值排名靠前的靶點從PDB數據庫（https：//www．rcsb．org/）中找出其 3D 結構，通過 AutoDock Tools 1．5．6逐一對接，只保留Affinity（kcal/mol）絕對值最高的對接結果，并用R語言繪制熱圖。再利用Pymol軟件進行可視化呈現。

2 結果

2.1 腎疏寧活性成分靶點獲取 初步提取腎疏寧的中藥成分，篩選得到有效成分柴胡17種，黃芪20種，黃芩36種，丹參65種，鬼箭羽8種，山茱萸20種，萹蓄2種，白花蛇舌草7種，益母草8種。得出每味藥物成分的作用靶點，柴胡88個，黃芪98個，黃芩62個，丹參74個，鬼箭羽82個，山茱萸42個，萹蓄69個，白花蛇舌草88個，益母草100個，合并刪除重復值后得到靶點232個。根據OB和DL高低篩選出主要活性成分為山柰酚、槲皮素、異鼠李素、豆甾醇等（見表1）。

表1 腎疏寧主要活性成分的基本信息Tab.1 Basic information of main active components of Shenshuning

2.2 腎間質纖維化相關靶點獲取 從Genecards數據庫找出疾病靶點 2 783個，設定 Score＞5．3（中位數）。并結合OMIM、TTD數據庫補充相關靶點，合并刪除重復值后得到1 371個相關靶點。將篩選的藥物靶點與疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖，得到中藥藥物成分-疾病共同靶點116個（見圖1）。

圖1 腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of the components of Shenshuning-RIF target

2.3 腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點網絡圖構建 運用CytoScape3．8．0構建腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點網絡圖（見圖2）。中藥與疾病相關的活性成分130個，包含中藥共有成分10個（見表2），藥物獨有成分丹參56個、黃芩28個、柴胡8個、山茱萸8個、黃芪14個、白花蛇舌草1個、益母草4個、鬼箭羽1個、扁蓄0個。并分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，其中排名前8的成分依次為槲皮素、矮牽牛素、異鼠李素、花生四烯酸、山奈酚、丹參酮、聯苯酸脂、豆甾醇（見表3）。

圖2 腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點網絡圖表Fig.2 Target network of the components of Shenshuning-RIF target

表2 腎疏寧不同藥物的相同活性成分Tab.2 The same active components of different drugs of Shenshuning

腎間質纖維化的主要病理過程包括：上皮-間質細胞轉分化（EMT）、細胞外基質（ECM）沉積、氧化應激、細胞凋亡、血管緊張素系統活性升高及各種細胞因子間的相互作用等[14]。本研究基于網絡藥

2.4 PPI網絡構建 將腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點提交至STRING11.0平臺，利用Cytoscape3.8.0軟件構建PPI網絡（見圖3），并根據其degree值將其可視化（見圖4）。腎疏寧治療RIF的主要潛在靶點為腫瘤壞死因子（TNF），蛋白激酶B1（AKT1），JUN，絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1），RELA，TP53。

圖3 腎疏寧成分-腎間質纖維化靶點PPI網絡Fig.3 PPI network of the components of Shenshuning-RIF target

圖4 腎疏寧治療腎間質纖維化主要靶點可視化Fig.4 Visualized bar chart of degree value of targets of Shenshuning in the treatment of RIF

2.5 富集分析 應用DAVID 6.8數據平臺對腎疏寧防治腎間質纖維化相關靶點進行分析，通過在線繪圖網站bioinformatics以及R語言將其結果進行可視化呈現（見圖5）。GO富集結果表明腎疏寧治療疾病可能通過炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激反應等過程調節發揮作用。KEGG分析結果顯示這些靶點主要富集映射在 TNF、NF-κB、AGE-RAGE 等高度相關的信號通路（見圖6、表4）。并以前25條通路構建腎疏寧防治腎間質纖維化的靶點-通路網絡圖（見圖7）。

圖5 腎疏寧防治腎間質纖維化靶點GO分析Fig.5 GO analysis of the target point of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

圖6 腎疏寧防治腎間質纖維化靶點KEGG分析Fig.6 KEGG analysis of the target point of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

圖7 腎疏寧防治腎間質纖維化的靶點-通路網絡圖Fig.7 Target-pathway network of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

表4 腎疏寧防治腎間質纖維化靶點通路富集結果Tab.4 Enrichment results of target pathway of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

2.6 分子對接 結果顯示有效活性成分豆甾醇、丹參酮、異鼠李素與核心靶點之間有較好的結合活性；核心靶點TNF、RELA與有效成分的結合活性較好（見圖8）。同時借助Pymol2.5.0軟件分別對山奈酚與TNF，異鼠李素與TNF，豆甾醇與TNF，丹參酮與TNF，異鼠李素與RELA，豆甾醇與RELA進行分子對接可視化（見圖9）。

圖8 腎疏寧中的關鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接熱圖Fig.8 Heat map of the docking between key active compounds and PPI core target protein in Shenshuning

圖9 腎疏寧中關鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接Fig.9 Docking of key active compounds and PPI core target protein in Shenshuning

3 討論

腎間質纖維化是CKD的病理標志和主要表現[1]。依據其臨床癥狀及發病特點，中醫可歸屬于“水腫”“癃閉”“關格”“虛勞”“腎風”等病證范疇[11-12]。黃文政教授認為濕熱內蘊是本病的主要病機，腎疏寧是在以“少陽主樞”“三焦氣化”為理論指導創立的，以疏利少陽為主要治則，并兼有補腎氣、降瘀濁、解濕毒的功效。方中柴胡、黃芩為主，樞利少陽三焦濕熱；黃芪、益母草、山萸肉益氣養陰，補肝腎；丹參、鬼箭羽、萹蓄、白花蛇舌草等清濕熱活血解毒。諸藥搭配，疏利少陽，扶正祛邪[13]。理學對中藥復方深入分析挖掘，闡述腎疏寧防治腎間質纖維化在整體分子水平上的作用機制[15]，研究結果顯示腎疏寧可作用于RIF的中藥活性成分有130種，相關作用靶基因116個。KEGG分析結果顯示腎疏寧防治腎間質纖維化主要作用與TNF、NF-κB、AGE-RAGE 等信號通路有關，尤以 TNF、NF-κB通路密切相關。

TNF-α是參與腎間質纖維化重要的炎癥因子之一，能夠有效刺激腎小管上皮細胞產生一系列炎癥細胞，誘導腎小管上皮轉分化或凋亡，加速腎間質纖維化發展。TNF-α還能通過刺激NF-κB通路將其活化誘導細胞的表型轉化[16]。被激活的NF-κB反過來促進TNF-α的形成，使NF-κB與TNF-α形成反饋環[17]。NF-κB作為炎性反應基因，在腎小球細胞、腎小球上皮細胞和腎小管上皮細胞中均有表達[18]，被激活后能產生更多的炎性因子，發生炎癥反應，促進腎纖維化的發展。另外，NF-κB還可誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化，也可導致纖維化形成。AGE-RAGE信號通路是通過促進腎臟的炎癥反應和纖維化過程，促使腎臟結構損傷，最終導致腎功能喪失。AGE-RAGE通路可通過誘導NF-κB的激活和氧化應激作用，進一步刺激促炎細胞因子產生。

研究發現轉化生長因子-β（TGF-β）的表達隨著NF-κB的活化而升高[14]，TGF-β1目前被認為是腎間質纖維化過程中最關鍵的生長因子之一，TGF-β1是EMT過程的主要誘導因子，對腎間質纖維化發生、發展的多個環節有重要影響。通過研究可得腎疏寧可能主要通過調節TNF蛋白靶點激活NF-κB通路，減少炎性因子和纖維形成因子產生[15]，同時也會調節TGF-β/Smad信號通路，從而減少肌成纖維細胞數量，調節ECM的表達，減少細胞炎性損傷，抑制炎癥反應和纖維化過程，起到治療腎間質纖維化的作用。

為了進一步驗證腎疏寧對RIF治療作用的藥效物質基礎，本研究對腎疏寧的核心化合物與TNF、RELA進行分子對接分析，可見核心活性化合物均能與TNF、RELA通過氫鍵等作用穩定結合。氫鍵是穩定對接體系的重要作用力[19]，核心活性化合物與TNF、RELA結合均有氫鍵形成。一般認為，結合能絕對值大于5 kcal/mol表明化合物與靶點蛋白之間結合活性較好；絕對值大于7.0 kcal/mol表明小分子與受體蛋白具有很強的結合活性[20]。分子對接結果顯示山奈酚與TNF結合能絕對值為8 kcal/mol，丹參酮與TNF結合能絕對值為8.3 kcal/mol，異鼠李素與TNF結合能絕對值為8.3 kcal/mol，異鼠李素與RELA結合能絕對值為8.3 kcal/mol。值得一提的是，豆甾醇與TNF結合能絕對值為10 kcal/mol，豆甾醇與RELA結合能絕對值為9.7 kcal/mol。根據研究結果考慮豆甾醇在調節RIF過程中發揮重要作用。湯利華等[21]研究發現，山奈酚可降低TNF-α等的表達，使炎性細胞浸潤降低，緩解腎組織損傷。研究結果顯示丹參酮可通過改變TGF-β/Smad和NF-κB通路的表達來抑制RIF和炎癥反應[22]。田鋒等[23]認為異鼠李素其作用機制可能是抑制了NF-κB信號轉導系統的過度活化及氧化應激。同時腎疏寧中多種活性成分都對RELA表達產生影響，通過抑制NF-κB的蛋白表達，減少炎癥反應，從而達到防治腎間質纖維化的目的。

本研究利用網絡藥理學與分子對接技術，分析了腎疏寧治療腎間質纖維化的作用機制，揭示了腎疏寧防治RIF可能的相關信號通路、靶點蛋白及活性化合物，為臨床慢性腎臟病的防治和后續深入研究奠定了理論基礎。但由于網絡藥理學分析方式存在局限性、中藥復方較復雜、藥物間相互作用不明確及體內代謝差異等的影響，無法明確中藥成分的全部藥理作用，還需要臨床試驗和動物試驗來進一步驗證。