補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2/Keap1通路的調(diào)節(jié)作用研究*

李振華，李姣，張健

（1．郴州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)婦科，郴州 423000；2．湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科，長(zhǎng)沙 430000）

子宮內(nèi)膜異位癥作為一種常見的婦科疾病，好發(fā)于育齡婦女，并會(huì)引發(fā)痛經(jīng)及不孕等多種并發(fā)癥，臨床中使用孕激素類及卵巢功能抑制劑進(jìn)行治療，但由于用藥療程過長(zhǎng)且不良反應(yīng)較多，所以在臨床應(yīng)用中效果并不理想。同時(shí)，除根治性手術(shù)外，其余藥物治療及手術(shù)治療的方法均有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，所以對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥藥物的研發(fā)亟待解決[1-3]。補(bǔ)腎活血湯作為一種傳統(tǒng)的中藥成方制劑，其被用于治療損傷后期肝腎虛弱之癥，因其具有通絡(luò)止痛活血之功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)眾多學(xué)者開始探究其在子宮內(nèi)膜異位癥治療中的作用，并隨著研究的深入，眾多學(xué)者報(bào)道了補(bǔ)腎活血湯在子宮內(nèi)膜異位癥臨床應(yīng)用中均表現(xiàn)出顯著療效[4-5]。Nrf2/Keap1通路是與炎癥損傷及氧化應(yīng)激過程密切相關(guān)的重要通路，近年來研究證實(shí)Nrf2/Keap1通路相關(guān)蛋白水平異常，在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制中的起到關(guān)鍵作用[6-7]。Marcelli等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2水平的升高會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生及進(jìn)展；Kapoor等[9]研究表明，Nrf2水平的升高及Keap1水平降低均會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)一步加重。本文通過研究補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2/Keap1通路的調(diào)節(jié)作用，為補(bǔ)腎活血湯在子宮內(nèi)膜異位癥中的藥理機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠90只，雌性，8周齡，體質(zhì)量200～220 g，SPF級(jí)，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（甘）2018-0002]。

1.2 藥品與試劑 補(bǔ)腎活血湯（由熟地黃10 g，補(bǔ)骨脂10 g，菟絲子10 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，當(dāng)歸尾3 g，山萸肉 3 g，肉蓯蓉 3 g，沒藥 3 g，獨(dú)活 3 g，紅花2 g組成）藥材飲片購自北京同仁堂藥業(yè)，由藥材飲片制成生藥含量為1 g/mL的制劑。達(dá)那唑（批號(hào)：201812161）購自杭州民生藥業(yè)有限公司；大鼠雌二醇（E2）ELISA 檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：CSB-E05110r-1）購自上海恒斐生物公司；大鼠CA125ELISA試劑盒（貨號(hào)：ER0788）購自武漢菲恩生物科技有限公司；組織蛋白裂解液（貨號(hào)：ZY-14497）購自上海澤葉生物公司；Nrf2、Keap1兔多克隆抗體（貨號(hào)：PA5-27882、PA5-99434）購自賽默飛世爾科技公司；cDNA合成試劑盒（貨號(hào)：D7168）、總RNA提取試劑盒（貨號(hào)：R0016）、GAPDH 兔單克隆抗體（貨號(hào)：AF1186）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（貨號(hào)：A0208）購自碧云天生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)：JKG039）購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；BCA蛋白法含量測(cè)試盒（貨號(hào)：BCAP-1-W）購自北京康佳宏原生物科技有限公司；大鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（貨號(hào)：EK0412）購自美國Sciencell公司；大鼠白介素-8（IL-8）ELISA 試劑盒（貨號(hào)：YS03585B）購自美國GTX公司；前列腺素F-2α（PGF-2α）ELISA 試劑盒（貨號(hào)：GD-AW1766）購自上海古朵生物科技公司。

1.3 主要儀器 GIS-500凝膠成像儀（杭州米歐儀器公司）；Allegra X-15R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；IX71-F22FL/PH熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；LUMIstar Omega酶標(biāo)儀（德國BMG公司）；HM355S石蠟切片機(jī)（日本亞速旺公司）；BE6085電泳槽（柏奧易杰科技有限公司）。

2 方法

2.1 建立子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠并給藥 90只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組及達(dá)那唑組，15只/組，參照文獻(xiàn)[10-12]方法采用自體子宮內(nèi)膜移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠，先使用0．5 mg/kg的戊酸雌二醇使大鼠動(dòng)情，然后將大鼠麻醉，開腹，分離左側(cè)部分子宮，并將子宮內(nèi)膜縫合至右側(cè)腹壁，關(guān)腹縫合，術(shù)后使用青霉素預(yù)防感染，假手術(shù)組只開腹不進(jìn)行子宮內(nèi)膜移植等操作。補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組按照 2．5、5、10 g/kg 灌胃給予補(bǔ)腎活血湯[13-14]，達(dá)那唑組給予達(dá)那唑（0．02 g/kg）[12]，假手術(shù)組及模型組給予生理鹽水；1次/日，連續(xù)干預(yù)4周[8]。

2.2 血清E2、CA125的測(cè)定 大鼠取血清，使用E2、CA125 ELISA試劑盒測(cè)定各組大鼠血清E2、CA125水平。

2.3 腹腔灌洗液IL-6、IL-8、PGF-2α的測(cè)定 末次給藥24 h后將大鼠麻醉，開腹，使用蒸餾水灌洗并收集腹腔液，采用 IL-6、IL-8、PGF-2α ELISA 試劑盒測(cè)定大鼠腹腔灌洗液IL-6、IL-8、PGF-2α水平。

2.4 HE染色 取大鼠異位子宮組織（假手術(shù)組取在位子宮組織）在中性甲醛中固定后石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，行HE染色，在200倍顯微鏡下采用盲法觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)特征。

2.5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Nrf2、Keap1mRNA 大鼠處死并分離異位子宮組織（對(duì)照組取在位子宮組織）200 mg，使用試劑盒提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒方法檢測(cè)Nrf2、Keap1 mRNA 水平，以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量，引物序列為Nrf2：Forward：GGTGCCTATG TCTCAGCCTCTT，Reverse：GCCATAGAACTGATGA GAGGGAG；Keap1：Forward：GGCATTTGGAGAAA GCAGTAGTC，Reverse：AGTGGAACGCATCCAAGTC GGC；GAPDH：Forward：GACTACAGGCATTGTGGAG ACC，Reverse：GGTCGTAATCACTGAGAGCCAC。

2.6 Westrn blot取大鼠異位子宮組織（對(duì)照組取在位子宮組織）加入裂解液研磨，離心取上清液，水浴煮沸變性并進(jìn)行總蛋白定量，取適量蛋白進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，使用1∶500倍稀釋后的Nrf2、Keap1抗體孵育，再使用山羊抗兔IgG抗體孵育，最后使用凝膠成像系統(tǒng)，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件對(duì)組織內(nèi)Nrf2、Keap1水平定量分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清E2、CA125的影響 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清E2、CA125的影響見表1。結(jié)果表明，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠血清E2、CA125水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與模型組子宮內(nèi)膜異位癥大鼠相比，補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組及達(dá)那唑組大鼠血清E2、CA125水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），且大鼠血清 E2、CA125 水平隨著補(bǔ)腎活血湯劑量的增加而降低。

表1 大鼠血清E2、CA125水平（±s）Tab.1 Serum E2 and CA125 levels of rats（±s）

表1 大鼠血清E2、CA125水平（±s）Tab.1 Serum E2 and CA125 levels of rats（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與補(bǔ)腎活血湯低劑量組相比，△P＜0．05；與補(bǔ)腎活血湯中劑量組相比，▲P＜0．05。

組別 E2（pg/mL） CA125（U/mL）假手術(shù)組 43．91±2．15 7．08±0．31模型組 92．91±1．64* 15．96±0．43*補(bǔ)腎活血湯低劑量組 73．01±2．72# 10．82±0．35#補(bǔ)腎活血湯中劑量組 66．55±1．33#△ 8．77±0．23#△補(bǔ)腎活血湯高劑量組 52．77±1．86#△▲ 7．67±0．30#△▲達(dá)那唑組 48．17±1．98# 7．36±0．27#

3.2 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α的影響 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α的影響見表2。結(jié)果表明，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與模型組子宮內(nèi)膜異位癥大鼠相比，補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組及達(dá)那唑組大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），隨著補(bǔ)腎活血湯劑量的增加，大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α水平逐漸降低。

表2 大鼠腹腔 IL-6、IL-8、PGF-2α 水平（±s）Tab.2 Levels of IL-6，IL-8 and PGF-2α in the abdominal cavity of rats（±s）

表2 大鼠腹腔 IL-6、IL-8、PGF-2α 水平（±s）Tab.2 Levels of IL-6，IL-8 and PGF-2α in the abdominal cavity of rats（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與補(bǔ)腎活血湯低劑量組相比，△P＜0．05；與補(bǔ)腎活血湯中劑量組相比，▲P＜0．05。

組別 IL-6（pg/mL） IL-8（pg/mL） PGF-2α（mg/mL）假手術(shù)組 51．75±3．43 128．01±3．71 418．25±21．81模型組 167．48±4．01* 258．54±2．74* 689．12±38．24*補(bǔ)腎活血湯低劑量組 102．11±2．81# 203．95±2．69# 592．79±34．51#補(bǔ)腎活血湯中劑量組 78．76±2．28#△ 181．36±3．35#△ 501．84±24．54#△補(bǔ)腎活血湯高劑量組 62．17±3．23#△▲ 146．51±3．75#△▲ 434．19±27．36#△▲達(dá)那唑組 64．71±2．51# 139．20±2．81# 466．29±29．94#

3.3 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病理學(xué)的影響 大鼠子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈柱狀，無明顯病理性改變；模型組子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜增厚，腺上皮和淺上皮形成高柱，可見明顯的增生；補(bǔ)腎活血湯各劑量組及達(dá)那唑組大鼠異位內(nèi)膜增厚減輕，柱狀結(jié)構(gòu)接近正常，腺體和腺上皮細(xì)胞數(shù)量接近正常。

圖1 大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)檢查（HE，×200）Fig.1 Pathological examination of rat endometrium（HE，×200）

3.4 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1mRNA水平的影響 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1mRNA的影響見表3。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Nrf2 mRNA水平升高，Keap1mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與模型組子宮內(nèi)膜異位癥大鼠相比，補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織Nrf2 mRNA水平降低，Keap1 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表3 大鼠 Nrf2、Keap1 mRNA 水平（±s）Tab.3 Nrf2 and Keap1 mRNA levels in rats（±s）

表3 大鼠 Nrf2、Keap1 mRNA 水平（±s）Tab.3 Nrf2 and Keap1 mRNA levels in rats（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與補(bǔ)腎活血湯低劑量組相比，△P＜0．05；與補(bǔ)腎活血湯中劑量組相比，▲P＜0．05。

組別 Nrf2 mRNA Keap1 mRNA假手術(shù)組 1．31±0．06 5．54±0．12模型組 7．86±0．12* 0．61±0．08*補(bǔ)腎活血湯低劑量組 4．93±0．26# 1．33±0．05#補(bǔ)腎活血湯中劑量組 3．36±0．09#△ 2．41±0．26#△補(bǔ)腎活血湯高劑量組 1．79±0．15#△▲ 4．72±0．17#△▲達(dá)那唑組 2．04±0．13# 3．79±0．32#

3.5 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1水平的影響 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1水平的影響見圖2。結(jié)果表明，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜Nrf2水平升高，Keap1 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與模型組子宮內(nèi)膜異位癥大鼠相比，補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織Nrf2水平降低，Keap1 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖2 補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1水平的影響Fig.2 Effects of Bushen Huoxue decoction on Nrf2 and Keap1 levels in endometriosis rats

4 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床中常見的女性婦科疾病，臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、月經(jīng)異常、不孕等癥狀，其發(fā)病機(jī)制與女性經(jīng)血逆流、性激素及炎癥刺激、免疫缺陷、遺傳等因素有關(guān)[15]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥與女性經(jīng)絡(luò)氣血壅滯不通，臟腑氣血運(yùn)行失常，聚集與盆腔留滯胞絡(luò)；又由于外邪內(nèi)生，正氣耗損，邪氣藏于體內(nèi)，久聚不散，若遇到情志失調(diào)、勞思傷神，則邪氣伺機(jī)而出；此外，正氣不足加之衛(wèi)外不固，外感風(fēng)寒、血液黏滯、痰濕氣短等病癥均為誘因。所以，對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥的治療中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)活血化瘀、補(bǔ)正益氣、通絡(luò)止痛是關(guān)鍵。

補(bǔ)腎活血湯出自中國古代醫(yī)學(xué)著作《傷科大成》，由熟地黃、菟絲子、杜仲等藥材組成，有活血止痛之功效，用于治療肝腎虛弱等病癥。中醫(yī)理論認(rèn)為，肝腎虧損則導(dǎo)致筋骨失養(yǎng)，進(jìn)而引起血行瘀滯，經(jīng)脈不暢，使用補(bǔ)益肝腎之藥材，則起到活血通絡(luò)止痛的功效。補(bǔ)腎活血湯中熟地黃、杜仲、補(bǔ)骨脂等藥材起到滋陰補(bǔ)血，補(bǔ)精益腎，陰陽調(diào)和之功效，當(dāng)歸尾來源于中藥材當(dāng)歸尾部，有活血祛瘀之功效，對(duì)經(jīng)閉不通有奇效，沒藥散瘀消腫，去痛生肌，獨(dú)活通痹止痛，除風(fēng)祛濕，紅花活血通經(jīng)，散瘀止痛的作用，對(duì)于閉經(jīng)、通經(jīng)等癥狀有顯著療效，諸藥合用，標(biāo)本兼治，驅(qū)邪扶正，起到通絡(luò)活血的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[16-17]，補(bǔ)腎活血湯對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥有一定的治療作用，補(bǔ)腎活血湯在治療子宮內(nèi)膜異位癥的臨床應(yīng)用中，劉凱麗等[18]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血湯能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及子宮內(nèi)膜的容受性；湯麗婷[19]通過臨床回顧性研究報(bào)道，補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥引起的不孕癥患者最大卵泡直徑、內(nèi)膜囊腫體積等均有明顯改善作用，可見補(bǔ)腎活血湯對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥的治療表現(xiàn)出巨大潛力。

研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，在子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)，E2及CA125水平顯著升高，并提示E2及CA125能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的疾病進(jìn)展，影響預(yù)后；IL-6及IL-8是體內(nèi)重要的炎癥因子，機(jī)體細(xì)胞受到各種刺激信號(hào)時(shí)，體內(nèi)IL-6及IL-8水平明顯升高并促進(jìn)體內(nèi)炎癥水平的進(jìn)展加重[22]，PGF-2α則能夠起到放大疼痛信號(hào)并誘導(dǎo)炎癥進(jìn)一步加劇[21]，在子宮內(nèi)膜異位癥患者及動(dòng)物模型腹腔液中均提示IL-6、IL-8及PGF-2α水平的升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組大鼠相比，補(bǔ)腎活血湯各劑量組大鼠血清E2、CA125水平及腹腔灌洗液IL-6、IL-8及PGF-2α水平隨著補(bǔ)腎活血湯劑量的增加而逐漸降低，這提示補(bǔ)腎活血湯能夠呈劑量依賴性的降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔炎癥水平并抑制子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)一步惡化進(jìn)展。

Nrf2能夠通過調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，Keap1與肌動(dòng)蛋白結(jié)合存在細(xì)胞漿中，并能夠與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)合以復(fù)合物的形式存在[23]。在氧化應(yīng)激條件下，Keap1被氧化，進(jìn)而使Keap1-Nrf2復(fù)合物的穩(wěn)定狀態(tài)被破壞，促進(jìn)細(xì)胞Nrf2水平的升高，激活下游與細(xì)胞周期、增殖等生理活動(dòng)相關(guān)的蛋白通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活[24]。有研究表明[25-28]，Nrf2能夠參與細(xì)胞中嘌呤合成的合成過程，誘導(dǎo)葡萄糖和谷氨酰胺進(jìn)入合成代謝途徑，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)Nrf2水平的升高能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而加速了子宮內(nèi)膜異位癥的疾病進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予子宮內(nèi)膜異位癥大鼠不同劑量的補(bǔ)腎活血湯后，與模型組大鼠相比較，補(bǔ)腎活血湯各劑量組大鼠異位子宮組織內(nèi)Nrf2 mRNA及蛋白水平降低，而Keap1mRNA及蛋白水平升高，且與補(bǔ)腎活血湯的劑量表現(xiàn)出依賴性，提示補(bǔ)腎活血湯能夠通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體內(nèi)Nrf2/Keap1通路相關(guān)蛋白水平，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體內(nèi)炎癥水平的抑制作用及病理改變的修復(fù)作用。同時(shí)，由于時(shí)間及實(shí)驗(yàn)條件的限制，本實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)一步研究補(bǔ)腎活血湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Nrf2/Keap1通路下游相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用，本課題擬在今后研究中對(duì)上述問題做深入探討。

綜上所述，補(bǔ)腎活血湯能夠降低大鼠血清雌二醇及CA125水平，緩解子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔炎癥水平，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1通路有關(guān)。