肝細胞癌骨轉移中APEX1和JAG1的表達及意義

方雪婷 張麗 蔡素琴 王聲耀 吳春林

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化道系統常見的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤死因中位居第4位，復發和轉移是導致患者死亡的主要原因。大多數患者在疾病晚期被診斷出來，5年生存率4.7%～32.8%[1]。此外，肝外轉移很常見，最常見的肝外轉移部位是肺，其次是骨、淋巴結和腎上腺。文獻報道，肝細胞癌骨轉移（hepatocellular carcinoma bone metastasis，HCC-BM）的發生率為3%～20%[2]。脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APEX1）具有DNA損傷修復功能以及氧化還原功能，可以調節多種轉錄因子，與細胞的增殖活化及部分腫瘤的轉移進展有關[3]。本研究小組前期實驗發現APEX1和Notch受體配體之一JAG1基因在肝細胞癌中的過表達具有相關性[4]?，F有的關于HCC-BM的報道較少，APEX1和JAG1基因是否促進HCC-BM尚不清楚。本研究收集福建醫科大學附屬第一醫院及第二醫院近年收治的HCC-BM病例，并采用免疫組化同時分析APEX1和JAG1在HCC及HCC-BM中的表達，通過對其臨床及病理特征的分析，探索肝細胞癌惡性進展新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 病例篩選

收集2012年1月—2019年12月就診于福建醫科大學附屬第一和第二醫院的肝細胞癌和肝外轉移患者進行資料分析。納入標準：（1）手術后病理檢查確診為肝細胞癌；（2）病理檢查確診為骨轉移。排除標準：（1）混合性肝細胞癌-膽管細胞癌患者；（2）原發灶為肝細胞癌，但骨轉移為其他來源的惡性腫瘤轉移（如肺癌骨轉移、原發骨腫瘤等）；（3）原發灶為肝細胞癌，可疑存在骨病變，但活體組織檢查或切除標本未發現惡性成分（包括無法取得可以證實存在肝細胞癌骨轉移標本的患者）。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2 臨床資料

一般資料包括患者性別、年齡等一般情況，骨轉移部位等。病理資料包括：肝腫瘤病理學類型、骨轉移灶病理學特征。

1.3 免疫組化染色

所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，進行HE及免疫組織化學Envision法染色，具體步驟根據說明書進行。APEX1、JAG1抗體購自英國abcam公司。JAG1陽性定位于細胞質，APEX1陽性定位于細胞質和/或胞核內，本研究將胞質的表達和胞核的表達分開評分。細胞著色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分[5]。根據陽性細胞所占的百分比分為：無著色細胞為0分，陽性細胞數≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分?？側旧u分=染色強度評分×陽性細胞百分比分數。＜4分定義為低表達，≥4分為高表達[5]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，免疫組化結果等計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料分析及骨轉移的部位及特點

2012年1月—2019年12月在福建醫科大學附屬第一和第二醫院接受治療的肝細胞癌和肝外轉移患者共464例，79例發生骨轉移；其中男性71例，女性8例，患者男女比例8.9∶1；年齡30～86歲，平均年齡（55.20±16.23）歲，中位年齡53歲。本研究共納入HCC-BM患者79例，其發生率為17.02%（79/464）。單發骨轉移灶者73例（92.40%），多發骨轉移灶者6例（7.59%）；其中5例發生2處骨轉移，1例發生3處骨轉移。單處骨轉移的發生率明顯高于多處骨轉移。最常見的骨轉移部位為脊柱59例（72.0%，含頸椎、胸椎、腰椎），其次為下肢骨轉移者9例（11.0%），上肢骨轉移者7例（8.5%）；少數患者亦可發生頜骨、胸骨、肩胛骨等部位，見表1。

表1 患者HCC-BM的分布

2.2 APEX1、JAG1蛋白在HCC及HCC-BM中的表達

APEX1蛋白在HCC中細胞核陽性率為55.7%（44/79），在HCC-BM中細胞核陽性率為65.8%（52/79）；兩者相比，APEX1蛋白在細胞核上的表達差異無統計學意義（χ2=1.699，P=0.192）。APEX1蛋白在HCC中細胞質陽性率為46.8%（37/79），在HCC-BM中，細胞質陽性率為63.3%（50/79）；兩者相比差異有統計學意義（χ2=4.323，P=0.038）。JAG1在HCC-BM中的陽性率為62.0%（49/79），在HCC中的陽性率為41.8%（33/79），兩組相比差異有統計學意義（χ2=6.490，P=0.011）。因此，在HCC-BM中APEX1蛋白、JAG1蛋白的表達均高于HCC。

2.3 APEX1、JAG1蛋白表達與HCC-BM臨床病理特征的關系

APEX1、JAG1蛋白與臨床病理參數關系的結果顯示，JAG1蛋白在HCC-BM中表達水平與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、原發灶數目等參數無關（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、是否合并骨外轉移有關（P＜0.05）；APEX1胞質的表達與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、骨轉移數目、是否合并骨外轉移無關（P＞0.05）；而與腫瘤的分化程度、原發灶的數目有關（P＜0.05），見表2。

表2 APEX1 和JAG1的表達與肝細胞癌骨轉移臨床病理特征的相關性

2.4 HCC-BM中APEX1、JAG1蛋白表達的相關性分析

在HCC-BM中，APEX1細胞核的陽性率65.8%，細胞質陽性率63.3%，JAG1陽性率62.0%；Spearman秩相關分析顯示APEX1細胞質表達高低與JAG1表達高低呈正相關（r=0.237，P=0.035）。

3 討論

HCC是消化系統常見的惡性腫瘤之一，隨著臨床診療水平的不斷進步，HCC患者的總生存時間獲得延長，但是HCCBM發生率則顯著升高，HCC骨轉移的篩查與診治已成為全球性熱點與難點問題。目前認為血管形成和上皮-間質轉化是HCC骨轉移的主要致病機制，因此明確HCC骨轉移的致病機制有助于臨床腫瘤篩查及診療手段的提高[6]。

本研究收集的HCC-BM病例中，性別比例8.9∶1；中位年齡53歲，提示中老年男性患者發生骨轉移的概率更大。由于HCC-BM少見，結合文獻結果報道，HCC-BM的發生率為13%～38.5%[7-8]。本研究共納入HCC-BM患者79例，其發生率為17.06%，與部分報道結果相近[8]。本研究顯示最常見的骨轉移部位為脊柱（72.0%，含頸椎、胸椎、腰椎），其次為下肢骨轉移者9例（11.0%），上肢骨轉移者7例（8.5%）；少數患者亦可發生頜骨、胸骨、肩胛骨等部位，與既往報道一致[9]。

索拉非尼是治療晚期HCC患者的主要化療藥物，但其療效受到耐藥的影響。有研究顯示APEX1的高表達與HCC患者對索拉非尼治療的耐藥性相關。APEX1在索拉非尼耐藥的HCC患者中的表達明顯高于索拉非尼敏感的HCC患者[10]。APEX1參與DNA損傷反應，并在多種人體組織中表達。APEX1的異常表達會破壞多種生理過程，包括細胞氧化還原穩態、平滑肌細胞遷移、細胞周期、細胞凋亡和mRNA穩定性[11]。同時，APEX1的表達與骨肉瘤患者的預后呈正相關，且APEX1與骨肉瘤發生順鉑耐藥密切相關。研究表明線粒體APEX1的高表達可以通過降低Rac1（p-Rac1）的磷酸化來降低ROS的產生，從而進一步促進骨肉瘤對順鉑的耐藥[12]。血清APEX1水平作為膽管癌診斷和預后的潛在生物標志物，在膽管癌患者中，有轉移的患者血清APEX1水平明顯高于無轉移的患者。血清APEX1水平越高，患者生存時間越短。血清APEX1水平可能是診斷和預后的生物標志物；并且APEX1的高表達與膽管癌的化療耐藥相關[13]。這些發現表明APEX1是HCC的潛在生物標志物，同時是腫瘤對化療敏感的潛在治療靶點。本實驗應用免疫組化方法檢測APEX1蛋白在79例HCC和HCC-BM中的表達情況，結果顯示在HCCBM中APEX1蛋白在細胞質中的表達高于肝細胞癌組織。分析APEX1的表達與臨床病理特征的關系發現，在HCC-BM中APEX1胞質的表達與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、骨轉移數目、是否合并骨外轉移無關（P＞0.05）；而與腫瘤的分化程度、原發灶的數目有關（P＜0.05）。結合本課題組前期工作[4]，發現APEX1胞質表達在肝細胞癌中較癌旁肝組織增加，而且在HCC-BM中的表達較肝細胞癌中增加，且APEX1的表達與腫瘤的分化程度、原發灶數目密切相關，說明APEX1的表達參與肝細胞癌轉移侵襲過程。

JAG1是5個細胞表面配體之一，主要在高度保守的Notch信號傳導途徑中發揮作用。JAG1在癌癥生物學的多個方面發揮作用，包括腫瘤血管生成、腫瘤細胞生長、癌癥干細胞、上皮-間質轉化和轉移過程[14]。在乳腺癌中，JAG1-Notch1-Zeb1-VEGFA介導的血管內分泌信號哺育乳腺癌干細胞[15]。在結腸癌中，JAG1介導APEX1促進腫瘤發生功能[3]。本組前期關于JAG1與HCC的研究中發現，JAG1在肝細胞癌中的表達增高，并且其表達與腫瘤術前AFP水平、分化程度、轉移、復發密切相關，JAG1可能為HCC潛在的獨立預后因子之一。本組結果表明JAG1在HCC-BM中的表達高于HCC，JAG1蛋白在HCC-BM中表達水平與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、原發灶數目等參數無關（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、是否合并骨外轉移有關（P＜0.05）。

在結腸癌中，APEX1異常表達并激活Notch信號通路[3]。在乳腺癌中，JAG1促使Notch1依賴性的Zeb1的上調，從而增加了血管內皮生長因子（VEGFA）的產生，并以旁分泌的方式相互誘導內皮細胞JAG1，強調針對血管內分泌的JAG1-Notch1-Zeb1-VEGFA信號通路可以降低乳腺癌的侵襲性[15]。Sun等[16]提出，DNA修復基因APEX1能夠促進一系列細胞因子、生長因子和蛋白酶的產生，其中包括VEGF，從而促進血管生成。APEX1在骨肉瘤中的高表達與通過缺氧誘導因子-1α的激活而上調的VEGF有關，降低APEX1的表達會導致VEGF表達的明顯下降[12]。在膀胱癌中，APEX1的表達也與VEGFA的表達和CD163+腫瘤相關巨噬細胞浸潤增加呈正相關[17]。APEX1在索拉非尼耐藥的HCC患者中的表達明顯高于索拉非尼敏感的HCC患者[10]。因此筆者猜想APEX1可能通過JAG1-Notch1-VEGFA信號通路調控腫瘤的發生發展過程。本組通過分析對比APEX1和JAG1在HCC-BM中的表達，發現HCC-BM中APEX1、JAG1的表達顯著增強，進一步統計分析發現APEX1與JAG1蛋白的表達之間呈正相關。在本課題組前期及本次結果顯示在組織學上APEX1和JAG1之間存在正相關，提示兩者在HCC的侵襲轉移中可能發揮作用，其具體機制尚需細胞學水平進一步驗證及補充，為HCC-BM的診治提供更多的理論基礎。