火棘果中多酚提取工藝優化

羅翠婷　 江富祥　董芬　曹莉

摘要：本研究以火棘果為原料，利用乙醇溶液提取其中的多酚，采用福林酚法測定多酚的含量。在單因素實驗的基礎上，利用中心組合設計和響應面分析優化多酚的提取工藝。結果表明火棘果中多酚的最佳提取工藝為： 料液比為1：12（g：mL），乙醇濃度為73%，PH為3.6，溫度為80℃，提取時間60min，提取次數為2次。依照優化條件的工藝，得到的多酚平均值為13.575 mg/g，與回歸方程計算得到的理論值響應值13.756 mg/g基本吻合，該研究為有效地利用我國火棘這一豐富的野生資源提供了理論依據。

關鍵詞：火棘;多酚類物;提取;響應面分析

火棘（Pyracantha fortuneana （Maxim） Li.）為薔薇科火棘屬植物，又名火把果、救命糧、赤陽子等，其分布很廣，多分布在亞洲東部至歐洲南部。火棘不僅具有觀賞價值，同時它也是重要的天然色素、果膠及飼料資源，而且它的果實的營養豐富，具有食用價值和藥用價值。研究表明火棘果具有較強的抗疲勞、降血脂、保護心肌、消食健脾和通便潤腸功效，同時可以滋潤及美白皮膚。

植物多酚是植物體內的復雜酚類次生代謝物，具有多元酚結構。多酚是火棘果重要的藥效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒的作用。目前對火棘果的研究主要集中在多糖、黃酮及原花青素等方面，而對其中多酚的提取及相關報道相對較少。另外，由于成分化學結構不明確，藥效成分的開發研究不夠深入，限制了多酚在功能性食品和醫藥制品領域的廣泛應用，進而制約了火棘果中醫藥產業的發展。本研究利用響應面優化試驗對火棘果多酚提取工藝進行探討，為充分利用火棘果多酚提供依據，這對于火棘果資源的深度開發和綜合利用具有極大的促進作用。

1材料與方法

1.1材料與試劑

火棘果：采摘湖北恩施來鳳地區。

標準品：沒食子酸（特級），上海源葉生物科技有限公司。

其它試劑：無水碳酸鈉、濃鹽酸、無水乙醇、正丁醇、丙酮、甲醇（以上均為分析純）、Foline-pheno。

1.2儀器

數字酸度計：杭州東星儀器廠;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿有限公司;754型紫外可見分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司;電熱恒溫水浴鍋：武漢琴臺醫療器械廠;臺式離心機：上海安亭科學儀器廠;循環水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠;電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1標準曲線的繪制

用10ml乙醇溶解0.5g沒食子酸標準品，用蒸餾水定容至100mL，然后分別移取0、1、2、3、5、10ml到100ml容量瓶中，用蒸餾水定容，分別稀釋成0、50、100、150、250、500mg/ml的溶液。用移液管分別移取20uL稀釋溶液到每個比色皿中，依次加入1.58mL水、100uL Foline-pheno試劑搖勻，等30s到8min，加入300uLNaCO 溶液搖勻，置于40℃恒溫水浴鍋中30min，顯色后于765nm波長下測定其吸收度。以沒食子酸標準品質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，即得回歸方程A=0.0052C+0.0664，其中R=0.9955，表明質量濃度為0～0.005 mg/mL時線性關系良好。

1.3.2火棘樣品中多酚含量測定

用移液管移取2.5ml樣品于25mL容量瓶中，精密吸取待測液20uL到比色皿中，依次加入1.58mL水、100uL Foline-pheno試劑搖勻，等30s到8min，加入300uLNaCO 溶液搖勻，置于40℃恒溫水浴鍋中30min，顯色后于765nm波長下測定其吸收度，由標準曲線計算多酚含量。

2結果與分析

2. 1單因素試驗

稱取火棘果皮肉粉10g，以乙醇為提取溶劑，一定料液比及提取溫度，回流提取一定時間后，冷卻至室溫后，分別過濾后定容至一定體積，用分光光度計在765nm處測定各浸提液的吸光度值。分別依次考察了乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比、pH值及提取次數對原花青素提取得率的影響，結果分別見圖1～圖6。

由圖1可知：隨著乙醇濃度的提高，多酚化合物的提取率呈上升的趨勢，當乙醇濃度達到70%時多酚化合物提取率最高，之后隨著濃度的增加，提取率反而降低。這是因為當高于此濃度后醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，多酚溶出量相對減少，故選70%的乙醇為提取條件。

由圖2可知：20～80℃時，多酚提取率隨溫度的升高而增大，在80℃時多酚得率最高。這是由于隨著溫度升高，多酚的滲透、溶解、擴散速度也加快，使其溶解度增加。但是高溫會促進多酚氧化分解，使其提取率下降。因此，火棘中多酚提取溫度不宜過高，提取溫度80 ℃最合適。

由圖3可知：隨著時間的增加，多酚的提取率不斷升高，在60min達到最大值，隨后趨于穩定。因為多酚化合物中某些熱穩定性差的成分會分解或在空氣中被氧化，導致提取率降低，因此，提取時間為60min最合適。

由圖4可知：多酚得率隨料液比的增長呈現先增加后平緩的趨勢，表明當料液比增大到1：10（g：mL）時原料中的多酚已被充分提取出來，多酚得率達到峰值，因而繼續增大料液比，多酚得率不會明顯提高。綜合考慮成本及后續濃縮處理，料液比選取1：10（g：mL）較為合適。

由圖5可知：酸性條件更有利于多酚的提取，其主要是因為酸可破壞蛋白質、多糖、纖維素與多酚的結合，從而提高多酚的提取率和提取速度。但過度酸化，會造成多酚酸解沉淀，多酚提取率反而下降，因此選取pH為3左右較合適。

由圖6可知：多次提取能增加多酚的提取量，但兩次提取已基本提取完全，再增加提取次數，提取量較少，而且隨著提取時間加長卻相反的引起多酚物質的分解，降低提取量，其他雜質成分也溶出增多，確定本次實驗提取兩次。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面優化設計方案

根據Box-Benhnken 中心組合實驗設計原理，在單因素試驗基礎上選取對火棘果多酚影響顯著的3個因素：投料比，乙醇濃度，PH值進行進一步優化考察，實驗因素與水平設計見表 1。

以X1（投料比）、X2（乙醇濃度）、X3（PH值）為自變量，以火棘果多酚提取率為響應值（Y），響應面試驗設計及結果見表2。

2.2.2模型的建立及顯著性檢查

利用design-expert7.1.6統計軟件對上表數據進行多元回歸擬合，經回歸擬合后，試驗因素對響應值的影響可用回歸方程表示為：

Y=-608.72039+4.92928X1+19.23890X2+8.16980X3+0.10904X1X2-0.34447X1X3+0.068925X2X3-0.49230 X1-0.14228 X2-1.26057 X3

從表回歸方程模型系數的顯著性檢驗可知模型一次項X1、X2、X3，二次項X1、X2、X3，交互項X1X3、X1X2對響應極顯著影響，X2X3對響應值顯著影響，表明料液比、乙醇濃度、PH值對多酚提取的主效應明顯，且在料液比、乙醇濃度和PH之間都存在交互作用。此外，F（X1）>F（X2）>F（X3）表明所選的3個因素中，投料比對多酚提取率影響最大，乙醇濃度次之，PH值相對最小。從該方程的方差分析可知本試驗所選模型不同處理間差異極顯著 P<0.0001，失擬項Lack of Fit =0.6584>0.05，說明回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時其應變量與全體自變量之間的線性關系是顯著的即這種試驗方法是可靠的，擬合情況好，可用此模型對火棘果多酚的提取進行分析和預測。

2.2.3響應面分析及最優條件的確定

采用design-expert7.1.6統計軟件繪制響應面圖及等高線，結果見圖10和圖11。由圖10可知，料液比和乙醇濃度對火棘果中多酚提取率的影響最為顯著，在料液比為7.5～12.5（g：mL），乙醇濃度為65%～75%交互作用下所得的多酚得率最高。

通過響應面分析，可得三個因子的最優實驗點代碼值為（0.33149，0.262916，0.292138），變換為真實值即為：料液比為11.65745（g：mL），乙醇濃度為72.62916%，PH值為3.584276，在此條件下提取的多酚是最好的，理論值可達13.756 mg/g。

2.2.4回歸模型的驗證實驗

按照優化的提取條件進行驗證實驗，重復3次，結果得多酚的平均含量為13.575mg/g，實驗值與模型的理論值13.756mg/g非常接近，說明優化提取條件重現性良好，此響應面優化回歸模型是合理可靠的，對實際工藝操作具有一定的指導意義。

3.結論

本研究建立了一個以火棘果多酚提取量為考察指標，以投料比、乙醇濃度、PH值、提取溫度、提取時間、提取次數為評價因素，通過中心組合設計和響應面分析，建立響應面模型。利用 Design-Expert 7.1.6軟件對回歸方程進行優化計算，確定了火棘果中多酚的最佳提取工藝條件：料液比為1：12（g：mL），乙醇濃度為73%，PH=3.6，溫度為80℃，提取時間60min，提取次數為2次。在此工藝條件下，多酚提取值為13.575 mg/g，與理論值響應值13.756mg/g基本吻合，進一步說明了響應面法優化提取火棘多酚是可行的，適合于提取火棘果中多酚工業化生產。

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作者介紹： 羅翠婷， 女，碩士研究生， 從事天然藥物化學、藥學教學研究.