解毒消癥飲通過VEGF-C/VEGFR-3信號途徑抑制肝癌淋巴管生成的機制研究

楊寓寧，魯 琴，林明和，杜 建，曹治云*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

腫瘤轉移是腫瘤致死的重要原因，腫瘤初期的生長主要通過誘導血管新生來提供其所需要的營養，而腫瘤轉移的主要途徑是通過誘導的新生淋巴管進行［1］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達和分泌可作為刺激因子，啟動血管內皮細胞和淋巴管內皮細胞相關信號通路，進而達到促血管新生和淋巴管生成的目的［2-4］?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）通過降解細胞周圍細胞外基質進而促進淋巴管細胞侵襲和遷移。由此可知血管內皮生長因子C（VEGF-C）/血管內皮生長因子受體3（VEGFR-3）通路及其下游MMPs在調節淋巴管的新生、重構和穩態中具有重要作用。解毒消癥飲（JXY）是清熱解毒的中藥驗方，主要由白花蛇舌草、夏枯草、山慈姑、苦參4味中藥組成。前期研究結果表明，JXY能夠抑制移植瘤小鼠VEGF的表達［5］；還可通過抑制肝癌細胞核內p300和CBP的表達，進而抑制其與低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）結合形成低氧誘導復合物，從而抑制VEGF的表達，最終下調腫瘤新生血管的生成［6］?；贘XY抗血管新生的作用及下調肝癌細胞表達VEGF-C的水平，本研究以VEGF-C/VEGFR-3為核心，進一步探討JXY抗肝癌淋巴管新生的作用機制，為JXY的進一步臨床應用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人淋巴管內皮細胞HLEC購自廣州吉尼歐生物技術有限公司，人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 實驗藥物 JXY藥物組成：白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇、苦參，購自福建中醫藥大學國醫堂。JXY經95%乙醇后，乙酸乙酯提取，水浴干燥后備用。JXY經DMSO溶解后制備成200 mg/mL的母液，超聲助溶，采用常溫PBS稀釋成實驗濃度。實驗中所需要的外源性VEGF-C，按照說明書指示將其溶解于雙蒸水，稀釋后使濃度達到5 ng/mL，超聲助溶后備用。

1.3 實驗試劑 ECM培養基（美國ScienCell公司）；高糖DMEM培養基（GIBCO公司）；胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國life technologies公司）；青霉素-鏈霉素混合液（美國Thermo Fisher Scientific公司）；MTT粉末（M8180）（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；管腔形成試劑盒（德國Merck Millipore公司）；VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2、MMP-9抗體（美國CST公司）；遷移小室（美國Corning公司）；Hoechst 33258染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 將HLEC細胞株和HepG2細胞株分別置于ECM完全培養基和DMEM完全培養基中，放置于恒溫箱內進行培養。當細胞匯合度達到70%～80%時，加入2 mL的胰蛋白酶消化2～3 min，隨后加入4 mL完全培養基終止消化，1 000 r/min離心3min后，吸棄上清并收集沉淀細胞用于后續實驗。

2.2 不同JXY濃度對細胞活力的影響 取對數生長期的細胞，以1×105/mL的密度接種于96孔板（100μL/孔），置于恒溫箱中培養過夜，當匯合度達到50%～60%時，將細胞分為0、0.05、0.1、0.2 mg/mL組，每組設置6個復孔，分別予相應濃度JXY干預培養24 h。培養后于顯微鏡下觀察不同藥物濃度下細胞的生長狀態和密度是否發生變化。拍照后吸棄培養液，加入100μL/孔的MTT，置于恒溫箱內4 h，棄舊液加入100μL/孔DMSO。最后在酶標儀內570 nm波長的設置下檢測OD值。

2.3 細胞分組 將細胞分為對照組、VEGF-C組、JXY低劑量組（簡稱低劑量組）、JXY中劑量組（簡稱中劑量組）、JXY高劑量組（簡稱高劑量組）。對照組每孔加入100μL ECM完全培養基，VEGF-C組予外源性因子VEGF-C（5 ng/mL）干預，低、中、高劑量組分別予VEGF-C（5 ng/mL）聯合不同濃度JXY（0.05、0.1、0.2 mg/mL）進行干預，每組均干預24 h。

2.4 細胞形態觀察 取對數生長期的HLEC細胞，按照1×105/mL的密度接種于6孔板中，當細胞平鋪于板底60%左右時，按“2.3”項進行分組干預。24 h后分別放置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態及形態并拍照。

2.5 MTT檢測細胞活力 取對數生長期的細胞，以1×105/mL的密度接種于96孔板，置于恒溫箱中培養過夜，當匯合度達到50%～60%時，按“2.3”項進行分組干預，每組設置6個復孔。24 h后于顯微鏡下觀察在不同藥物濃度下細胞的生長狀態和密度是否發生變化。拍照后吸棄培養液后加入100μL/孔的MTT，置于恒溫箱內4 h，棄舊液加入100μL/孔DMSO。最后在酶標儀內570 nm波長的設置下檢測吸光度值。

2.6 細胞凋亡實驗 采用Hoechst 33258染色法觀察細胞凋亡情況。取對數生長期的HLEC，按照1×105/mL的密度接種于6孔板，當細胞平鋪于板底60%左右時，按“2.3”項進行分組干預，干預后吸棄并使用1×PBS清洗，使用10%福爾馬林固定15 min，使用Hoechst 33258染色10 min（避光操作），隨后用熒光顯微鏡拍攝。

2.7 細胞遷移實驗 采用Transwell法檢測細胞遷移能力。取對數生長期的HLEC，按照1×105/mL的密度接種于6孔板，當細胞平鋪于板底60%左右時，按“2.3”項進行分組干預。干預后消化，空白ECM培養基重懸計數，將細胞稀釋為2.5×105/mL，并于Transwell上室、下室分別添加200μL基礎培養基和700μL ECM完全培養基，隨后置于恒溫培養箱孵育12 h。孵育后吸棄原培養基，使用10%福爾馬林固定和結晶紫染色各15 min，雙蒸水反復洗滌3次，用無塵紙擦拭干凈上室的貼壁細胞，晾置干燥后，放置于倒置顯微鏡鏡下拍照。

2.8 細胞劃痕實驗 應用劃痕實驗檢測細胞遷移能力。取對數生長期的HLEC，按照2.5×105/mL的密度接入6孔板進行培養，匯合度達到80%左右時，用無菌槍頭在6孔板底部劃一痕跡，用PBS清洗3次，拍照。按“2.3”項進行分組干預，分別于6、12、24 h不同時間點進行拍照并測量。

2.9 細胞管腔形成實驗 應用Tube Formation檢測體外淋巴管生成情況。取對數生長期的HLEC細胞，按照1×105/mL的密度接入6孔板，當細胞平鋪于板底60%左右時，按“2.3”項進行分組干預。干預后按照試劑盒說明書操作指示，于冷凍盒上配置基質膠150μL/孔平鋪于48孔板內，置于恒溫箱凝膠1 h。在此期間處理細胞，將細胞稀釋為2×105/mL，按200μL/孔加入已放有基質膠的48孔板中，再放入恒溫箱內孵育3 h，隨后在顯微鏡下鏡檢觀察并拍照。

2.10 Western blot法檢測VEGFR-3、MMP-9、MMP-2蛋白表達 取對數生長期的HLEC和HepG2細胞，分別按照1×105/mL的密度接種于6 cm小皿中，當細胞平鋪于板底60%左右時，將HepG2細胞分為0 mg/mL組和0.1 mg/mL組，0.1 mg/mL組予0.1 mg/mL JXY干預24 h，檢測2組VEGF-C蛋白表達；HLEC細胞按“2.3”項進行分組干預，檢測5組VEGFR-3、MMP-9、MMP-2蛋白表達。

2.11 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件包進行數據分析。計量資料符合正態分布的以（±s）表示；組間比較采用單因素方差分析。不符合正態分布以中位數和四分位數描述，組間比較采用非參數檢驗。

3 結果

3.1 不同濃度JXY對HepG2細胞活力和VEGF-C蛋白的影響 MMT法檢測細胞活力結果顯示，與對照組比較，JXY干預后各組細胞活力均有不同程度的下降，說明JXY對HepG2細胞活力有抑制作用，且呈現濃度依賴性（P＜0.01，圖1A）。Western Blot檢測JXY（0 mg/mL、0.1 mg/mL）干預24 h后的HepG2細胞VEGF-C蛋白的表達，結果如圖1B所示，同0 mg/mL組比較，0.1 mg/mL組的VEGF-C顯著下調（P＜0.01）。不同濃度JXY（0 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL）干預后發現細胞數量隨著JXY藥物濃度的增加呈梯度減少，結果如圖1C所示。

圖1 不同濃度JXY對Hep G2細胞活力及VEGF-C蛋白表達的影響（×200）

3.2 5組HLEC細胞形態及活力情況比較 如圖2所示，VEGF-C組與對照組比較，HLEC細胞生長形態正常，細胞密度顯著增大，細胞活力增高。各劑量組細胞形態出現固縮，細胞數量隨著JXY藥物濃度的增加呈梯度減少，細胞活力呈劑量依賴性的降低。

圖2 5組HLEC細胞形態及活力情況比較（×200）

3.3 5組HLEC細胞凋亡情況比較 如圖3所示，對照組細胞呈現弱藍色，有少許強熒光；VEGF-C組不僅細胞數量增加，還呈現出強熒光點減少，凋亡率與對照組比較明顯降低（P＜0.01）；各劑量組細胞數量減少，染色強熒光增加，且呈現出濃度依賴性，凋亡率與VEGF-C組比較明顯提高（P＜0.01）。

圖3 5組HLEC細胞凋亡情況比較（×200）

3.4 5組HLEC細胞遷移能力比較 如圖4所示，VEGF-C組細胞遷移數目較對照組顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，各劑量組遷移率逐漸下降（P＜0.01）。

圖4 5組HLEC細胞遷移能力比較（×200）

3.5 5組HLEC細胞損傷修復能力比較 如圖5所示，JXY具有抑制HLEC損傷修復能力的作用。劃痕24 h后，對照組HLEC細胞呈現出較好的遷移和自我損傷修復能力；VEGF-C組細胞的自我損傷修復能力較正常組有所提高。各劑量組細胞的遷移和損傷修復能力有所下降，且呈現濃度依賴性。

圖5 5組HLEC細胞損傷修復能力比較（×100）

3.6 5組細胞淋巴管生成情況比較 與對照組比較，VEGF-C組淋巴管生成管腔結構更加完整，數目顯著增加（P＜0.01）；各劑量組幾乎不能形成管腔，與VEGF-C組比較，管腔形成數量差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖6。

圖6 5組細胞淋巴管生成情況比較（×100）

3.7 5組VEGFR-3、MMP-9、MMP-2蛋白表達比較 如圖7所示，與對照組比較，VEGF-C組VEGFR-3、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與VEGF-C組比較，各劑量組VEGFR-3、MMP-9、MMP-2蛋白表達明顯下降（P＜0.01），且呈現劑量依賴性。

圖7 5組VEGFR-3、MMP-9、MMP-2蛋白表達比較

4 討論

淋巴管新生和重塑是腫瘤發生淋巴轉移的主要方式之一，其為腫瘤細胞提供了進入區域淋巴結的主要通道。而腫瘤細胞通過新生淋巴管轉移至淋巴結被視為腫瘤轉移的預后指標，抑制腫瘤的淋巴管新生被認為是抑制腫瘤轉移的有效方式，亦是腫瘤治療的重要靶點［7］。VEGFs家族是腫瘤血管新生與淋巴管新生的重要調控因子，腫瘤細胞分泌的VEGF-C與HLEC細胞表面的特異性受體VEGFR-3結合后，激活絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT和ERK并使之入核，上調MMP-2、MMP-9的表達，以調控HLEC細胞的增殖和遷移，進而引起腫瘤轉移［2］。MMP-2和MMP-9同時可誘導VEGF-A的表達，VEGF-A是目前最強的促腫瘤血管新生的細胞因子，其與血管內皮細胞特異性受體VEGFR-2結合后可增強血管通透性、促使細胞外基質變性、增強血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等，進而促進腫瘤的發展及轉移［4，8-10］。前期研究已表明JXY具有通過調控VEGF-A及VEGFR-2的表達，從而抑制體內外肝癌血管新生的作用［11］。鑒于VEGF家族及其受體在腫瘤生長及轉移中的核心調控作用，本研究進一步進行了JXY對肝癌淋巴管新生的影響研究，為模擬腫瘤微環境，以VEGF-C刺激的HLEC細胞為模型，經JXY干預后結果表明，JXY顯著抑制了體外HLEC的淋巴管生成，同時顯著下調了VEGFR-3和MMP-2、MMP-9的表達。

據報道，MMP-2和MMP-9能夠通過激活特定的細胞受體和生長因子將靶細胞從細胞外基質中釋放出來，從而調節細胞的增殖、凋亡和遷移［8］。同時，MMP-2和MMP-9可增強腫瘤細胞抵抗微環境中淋巴細胞對其誘導的凋亡。應用MMP-2和MMP-9的抑制劑與細胞因子TNF-α及TNF受體樣凋亡誘導配體具有協同促凋亡作用，可增強化療藥物的細胞毒性［12-13］。

本研究表明JXY不僅抑制HLEC模型細胞MMP-2、MMP-9的表達，同時促進了HLEC細胞的凋亡，抑制了HLEC細胞的遷移，這可能與前期報道的JXY增強5-FU化療效果有直接相關性。結合前期研究結果，JXY具有顯著抑制VEGFs及其受體的作用，而VEGF家族在調控腫瘤血管新生及淋巴管新生中均起著核心作用，通過抑制其特異性受體的表達及對MMPs蛋白的調控，抑制了細胞外基質的變性及血管內皮細胞、HLEC細胞的增殖及遷移，誘導了凋亡，從而達到抑制腫瘤轉移的目的。針對JXY抑制腫瘤轉移的具體信號通路有待進一步闡明。