壯骨健膝方含藥血清對脂多糖誘導兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應的效應濃度研究

林 震，郭潔梅，陳 鵬，肖 艷，張 鵬，張英杰，蘇友新*

（1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建 福州 350122；2.福建衛生職業技術學院，福建 福州 350101；3.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122）

90%膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）患者伴有不同程度的滑膜炎癥，且滑膜炎癥貫穿KOA發病的始終，其炎癥進展與KOA的病情發展呈正相關［1］。課題組前期從動物組織層面展開了研究，發現具有“痹痿同治”功效的壯骨健膝方可有效抑制兔KOA滑膜炎癥［2-4］。滑膜巨噬細胞作為KOA滑膜炎中的主要參與者［5］，可用于壯骨健膝方抗炎功效的研究。血清藥理學是以機體含藥血清代替藥物干預細胞的實驗方法，被廣泛應用于中藥復方的機制研究［6］。然而不同濃度的含藥血清對細胞的影響是多樣的［7］，高濃度血清在起效的同時可能會對細胞產生毒性作用，低濃度血清可能由于藥效物質濃度較低，達不到起效濃度，從而出現假陰性結果。因此在開展含藥血清干預細胞的相關研究時，有必要對效應濃度進行摸索。故本研究通過CCK8法和ELISA法研究壯骨健膝方含藥血清干預LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應的效應濃度，為后續相關實驗提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與細胞 3月齡普通級新西蘭大白兔12只，體質量（2.0±0.25）kg，由上海市松江區松聯實驗動物場提供，許可證編號：SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫藥大學實驗動物中心代購并飼養，許可證號：SYXK（閩）2014-0006。兔膝滑膜巨噬細胞由上海青旗生物技術發展有限公司提供，貨號：BFN2101831。

1.2 實驗藥物 壯骨健膝方組成：骨碎補15 g，杜仲9 g，川牛膝12 g，生地黃15 g，獨活6 g，雞血藤15 g，秦艽9 g，徐長卿9 g，土鱉蟲6 g。上述藥材均購于福建中醫藥大學國醫堂，并經福建中醫藥大學中西醫結合研究院曾建偉副研究員鑒定，符合《中華人民共和國藥典》要求。全方中藥飲片置于600 mL水中浸泡20 min后，用武火煎煮至沸騰，然后轉文火煎煮15 min，倒出藥液。再次加水400 mL，煎煮30 min。將2次所煎得的藥液混合，用旋轉蒸發儀濃縮成含生藥1 g/mL的壯骨健膝方藥液備用。

1.3 實驗試劑 DMEM培養基（美國HyClone公司，批號：AE29163339）；胎牛血清（澳洲ExCell Bio公司，批號：11G362）；烏拉坦（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z28N10Y104506）；脂多糖（中國Biosharp公司，貨號：BS007）；兔白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）和MMP-13 ELISA試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，批號：2112023、2112015、2112030、2112033）；CCK8試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：16J29C60）。

1.4 實驗儀器 ELX800型全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司）；IC-1000型Countstar細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；DMIL/DFC295型倒置相差顯光學微鏡（德國LEICA公司）；TDZ4A-WS型低速離心機（湖南湘儀儀器有限公司）；E163302型CO2培養箱（美國Thermo Scientific公司）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 含藥血清與空白血清制備 12只新西蘭大白兔，隨機分為壯骨健膝方組6只和空白組6只，根據前期研究并參照人與動物體質量折算的等效劑量［8］，壯骨健膝方組按4.58 mL/（kg·d）予壯骨健膝方藥液灌胃，空白組予等體積生理鹽水灌胃，分上下午2次，持續3 d。于末次給藥后1 h，應用20%烏拉坦（5 mL/kg）對兔進行腹腔注射麻醉，待角膜反射消失后行腹主動脈采血，全血靜置于4℃冰箱4 h后，2 500 r/min離心30 min，分離血清，將同組血清混合，56℃水浴滅活30 min，用0.22μm過濾器過濾，分裝即得。

2.2 不同濃度的血清完全培養液制備 取離心管，依次加入細胞培養液、壯骨健膝方含藥血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液，配制成5%、10%、15%、20%、25%壯骨健膝方含藥血清完全培養液（以下簡稱含藥完培），同法配制相同濃度空白血清完全培養液（以下簡稱空白完培）和10%胎牛血清完全培養液（以下簡稱普通完培），于-20℃冰箱保存備用。

2.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，數據符合正態分布，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗，不符合正態分布，采用非參數檢驗。

2.4 CCK8法篩選含藥血清干預濃度實驗 取生長狀況良好的兔膝滑膜巨噬細胞，按7×103個細胞/孔的密度接種于96孔板，隨機分為對照組、空白血清組及含藥血清組，分別采用普通完培、含藥完培（5%、10%、15%、20%、25%）和空白完培（5%、10%、15%、20%、25%）培養24 h，棄去原培養液，加入10%CCK8溶液避光孵育2 h，使用酶標儀在450 nm處測定每孔的吸光度。實驗結果顯示，5%、10%、15%含藥血清組細胞活性與同濃度下空白血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），故篩選出對細胞沒有毒性的3個含藥完培濃度（5%、10%、15%）作為后續實驗的干預濃度，見表1。

表1 不同血清培養液干預后兔膝滑膜巨噬細胞活性比較（±s）

表1 不同血清培養液干預后兔膝滑膜巨噬細胞活性比較（±s）

注：與同濃度空白血清組比較，1）P＜0.05。

組別對照組空白血清組含藥血清組n6 66666 66666含藥血清干預濃度/%-5 10 15 20 25 5 10 15 20 25細胞活性/%100.00±0.00 99.86±0.75 98.69±1.28 98.58±1.69 97.32±0.89 99.67±1.12 99.16±1.03 99.68±1.25 98.13±0.87 88.26±0.791）87.79±1.361）

2.5 篩選LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞致炎時間實驗 兔膝滑膜巨噬細胞以1×105個細胞/孔的密度接種于24孔板，隨機分為空白組和LPS組。空白組加入普通完培，LPS組加入含1.0μg/mL的LPS培養液，分別培養12、24、36、48 h后，收集各組細胞上清液，ELISA法檢測IL-1β、TNF-α含量。結果表明各組別上清液中于各檢測時間點均可見IL-1β、TNF-α的分泌。與空白組比較，LPS組各時間點的兔膝滑膜巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量均明顯升高（P＜0.05）；LPS組內各時間點比較，刺激12 h后滑膜巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量最高（P＜0.05），見表2。結合文獻［9］，以IL-1β、TNF-α含量較高的12 h作為后續實驗LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞致炎的時間。

表2 空白組和LPS組不同時間干預后細胞上清液IL-1β、TNF-α含量比較（±s）

表2 空白組和LPS組不同時間干預后細胞上清液IL-1β、TNF-α含量比較（±s）

注：與相同時間的空白組比較，1）P＜0.05；與12 h LPS組比較，2）P＜0.05；與24 h LPS組比較，3）P＜0.05；與36 h LPS組比較，4）P＜0.05。

組別空白組LPS組干預時間12 h 24 h 36 h 48 h 12 h 24 h 36 h 48 h IL-1β/（ng/L）12.55±1.01 13.05±1.51 13.90±1.34 11.50±0.33 41.20±1.341）26.70±0.671）2）24.34±0.331）2）19.29±3.371）2）3）4）TNF-α/（pg/L）284.89±10.00 292.90±26.01 280.89±18.01 290.90±4.00 410.99±40.031）356.94±22.011）2）346.94±8.011）2）338.93±12.011）2）

2.6 ELISA法檢測各組細胞上清中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量 兔膝滑膜巨噬細胞以1×105個/孔接種于6孔板，隨機分為空白組、模型組和5%、10%、15%含藥血清組，空白組添加10%空白完培，模型組和5%、10%、15%含藥血清組經1.0μg/mL的LPS培養液致炎12 h后，模型組添加10%空白完培，5%、10%、15%含藥血清組分別添加5%、10%、15%含藥完培，24 h后收集各組細胞上清液，ELISA法檢測各組上清中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量。結果顯示，各組均可見IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13的分泌，與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，10%、15%含藥血清組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量均明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組兔膝滑膜巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（n＝3，±s）

表3 各組兔膝滑膜巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（n＝3，±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別空白組模型組5%含藥血清組10%含藥血清組15%含藥血清組IL-1β/（ng/L）51.56±2.56 96.43±2.731）93.13±0.87 77.25±1.962）74.43±1.592）TNF-α/（pg/mL）456.88±11.25 587.67±8.561）582.33±15.22 526.94±18.522）519.17±15.892）MMP-3/（μg/L）18.97±1.57 44.35±1.011）41.95±1.67 33.87±0.892）31.86±1.362）MMP-13/（μg/L）130.61±3.49 220.94±4.011）217.18±3.78 173.13±4.212）168.50±2.712）

3 討論

KOA的發病雖以關節軟骨退變為主，但其病理變化并不僅限于軟骨局部［10-11］。越來越多的研究發現，滑膜炎癥與KOA的發生和發展密切相關，滑膜炎癥過程中各種因素反復刺激滑膜組織，促使炎癥因子、基質金屬蛋白酶等被大量釋放，它們在加重滑膜炎癥反應的同時，又反復刺激關節軟骨，造成軟骨的損害，進一步加劇KOA的進展［12-14］。

壯骨健膝方是蘇友新教授根據KOA“痹痿同病”病機特點所創立的效驗方，該方由骨碎補、杜仲、川牛膝等藥物組成，具有補肝腎、強筋骨、祛風濕、止痹痛之功用，臨床療效顯著［2-3］。本研究采用血清藥理學的方法，通過LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應，研究壯骨健膝方含藥血清抑制滑膜炎癥的效應濃度。結果發現5%、10%、15%壯骨健膝方含藥血清對兔膝滑膜巨噬細胞無毒性作用。進一步研究發現，10%、15%壯骨健膝方含藥血清可有效抑制LPS誘導的兔膝滑膜巨噬細胞炎性因子IL-1β和TNF-α以及基質金屬蛋白酶MMP-3和MMP-13的生成，發揮抑制滑膜炎癥的功效，為該方含藥血清的效應濃度，且二者抗炎作用相當。而5%壯骨健膝方含藥血清無顯著的抗炎作用，推測可能是血清濃度較低，血清中的有效成分濃度尚未達到起效水平所致。

綜上所述，本實驗結果表明10%、15%壯骨健膝方兔含藥血清為干預LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應的效應濃度，由于二者抗炎作用相近，為節約血清成本，故建議后續研究采用10%含藥血清更為適宜。