骨髓間充質干細胞來源外泌體對炎癥微環境中巨噬細胞表型及軟骨細胞的調控作用

邢逸，竇一鳴，王敏，徐海楠，楊強，孫遜，趙艷紅△

顳下頜關節骨關節炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA）是臨床中常見的頜面部關節疾病，發病率高。顳下頜關節軟骨無血管，無神經，骨關節炎所致軟骨缺損難以自我修復［1］，亟需更有效的治療手段來解決這一臨床難題。骨軟骨組織工程技術的發展為TMJ-OA提供了新的治療策略。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）已廣泛應用于骨軟骨組織工程領域［2］。已有研究證明間充質干細胞（MSCs）的治療作用主要通過旁分泌外泌體（exosomes，Exo）實現［3］。Exo是細胞分泌到胞外的直徑為40～160 nm的雙層脂質囊泡，可將蛋白質、微小RNA（miRNA）等運輸到靶細胞，實現細胞間通訊［4］。由于Exo較細胞療法具有更低的免疫原性，已作為細胞治療的替代療法應用在多種疾病的研究中。巨噬細胞（Mφ）是滑膜組織中參與骨關節炎（OA）炎癥和組織損傷修復過程的主要免疫細胞［5］，可分為經典激活M1 巨噬細胞（M1Mφ）和交替激活M2 巨噬細胞（M2Mφ）。M1Mφ釋放炎性因子促進炎癥微環境發展，M2Mφ 則產生抗炎因子抑制炎癥發展［6］。M1Mφ/M2Mφ 比例的不同導致了炎癥微環境中促炎/抗炎的平衡改變［7］。因而，M1Mφ和M2Mφ在TMJ-OA的發展過程中起到了關鍵作用，為TMJ-OA的防治提供了新的研究方向。轉化生長因子（TGF）-β1是一種軟骨形成誘導因子，可調控軟骨細胞增殖及軟骨細胞外基質的合成代謝，在OA的發病機制中起重要作用。相關研究已證實，抑制軟骨中的TGF-β1 信號傳導可導致關節軟骨退化［8］。因此，TGF-β1是維持軟骨完整性的重要靶點。本研究收集BMSCs 來源的Exo（BMSCs-Exo），旨在探討BMSCs-Exo 在炎癥微環境中對Mφ極化及促骨修復的調控作用，為治療TMJ-OA 提供具有潛在臨床應用價值的方向與方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料 BMSCs、小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7細胞系、原代軟骨細胞購自武漢普諾賽生物公司；DMEM 培養基、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司；ALG2相互作用蛋白X（Alix）抗體、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）抗體、一氧化氮合酶（iNOS）抗體、精氨酸酶-1（Arg-1）抗體、基質金屬蛋白酶（MMP）-13抗體購自Abcam公司；β-actin抗體、Ⅱ型膠原（COLⅡ）抗體、TGF-β1 抗體購自 Bioss 公司；白細胞介素（IL）-1β 購自Preprotech公司，干擾素（IFN）-γ購自R&D公司；RNA提取試劑盒購自福際生物公司；反轉錄試劑盒購自Takara 公司；qPCR SYBR?Green Master 試劑盒購自 Yeasen 公司；CCK-8試劑盒購自Biosharp 公司；GAPDH、iNOS、Arg-1、IL-1β、IL-6、COL2a1、TGF-β1 引物購自北京擎科生物科技有限公司；IL-1β、IL-6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自索萊寶公司。

1.2 研究方法

1.2.1 BMSCs、RAW264.7、原代軟骨細胞培養 將BMSCs、RAW264.7、原代軟骨細胞以4.0×104個/mL 的密度接種于培養瓶中，加入適量含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 完全培養基，置于5%CO2，飽和濕度的37 ℃培養箱中常規培養。細胞融合度為80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，使用完全培養基終止消化，1 000 r/min 離心5 min，以 1∶3 的比例傳代。取 P2-P9 的 BMSCs、P2-P5 的原代軟骨細胞及對數生長期的RAW264.7用于后續實驗。

1.2.2 BMSCs-Exo 的提取及觀察 BMSCs 傳代后細胞培養過夜，更換為不含外泌體血清的培養基培養48 h，收集細胞培養上清液，置于-80 ℃保存。將收集的上清液通過以下差速離心步驟收集BMSCs-Exo：300 ×g，10 min；2 000 ×g，10 min；10 000 ×g，30 min；120 000 ×g，90 min。超速離心后，棄去上清液，沉淀即主要為BMSCs-Exo，用1 mL PBS 重懸，0.22μm濾膜過濾，-80 ℃保存。將20μL BMSCs-Exo 懸液滴加在銅網上，室溫1 min后滴加20μL磷鎢酸溶液，1 min后吸去磷鎢酸溶液，紅外燈下烘烤10 min，吸去多余液體，透射電鏡（TEM）下觀察Exo結構。

1.2.3 BMSCs-Exo促巨噬細胞、軟骨細胞增殖能力檢測 將RAW264.7 以 2×103個/孔的密度接種于 96 孔板中，實驗分為對照組（0 mg/L Exo）、10 mg/L Exo組、50 mg/L Exo組。將軟骨細胞以2×103個/孔的密度接種于96 孔板中，實驗分為對照組、模型組（10 mg/L IL-1β 組）、治療組（IL-1β+10 mg/L Exo組、IL-1β+50 mg/L Exo 組）。細胞培養24 h 后分別在各組孔中加入100μL 含不同劑量BMSCs-Exo 的完全培養基，繼續培養24、48 h。在相應的時間點，每孔加入10μL CCK-8 反應液，置于37 ℃培養箱中反應2 h后，酶標儀檢測各孔450 nm處的光密度（OD）值，每組均重復4次。

1.2.4 BMSCs-Exo 對巨噬細胞極化表型的影響及對炎癥的調控 實驗分組同1.2.3。將RAW264.7 以1×104個/孔的密度接種于6 孔板中，細胞貼壁后，使用20 μg/L 的IFN-γ 刺激RAW264.7 細胞24 h，使其極化為M1Mφ 后，棄去培養基，分別更換為含0、10、50 mg/L BMSCs-Exo 的完全培養基，繼續培養24 h 后收集蛋白樣本及總RNA 樣本，以用于后續實驗。

1.2.5 BMSCs-Exo 對炎癥軟骨細胞的調控作用 實驗分組同1.2.3。將原代軟骨細胞以1×104個/孔的密度接種于6孔板中，細胞貼壁后，使用10μg/L 的IL-1β刺激模型組和治療組24 h；棄去培養基，在對照組和模型組中加入不含BMSCs-Exo的完全培養基，在治療組中分別加入含10 mg/L 和50 mg/L BMSCs-Exo的完全培養基，繼續培養24 h后收集蛋白樣本及總RNA樣本，以用于后續實驗。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測巨噬細胞極化表型、炎性因子表達及軟骨細胞表型 使用RNA提取試劑盒提取總RNA，Nanodrop 檢測所提RNA 濃度及純度。按照試劑盒說明加入反轉錄酶反轉錄及合成cDNA，-20 ℃保存。按照2×qPCR SYBR?Green Master的試劑盒說明配制反應體系，并上機檢測。反應體系為：qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50 個循環；熔解曲線 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。每組均重復 3 次。以GAPDH為內參基因，使用2-ΔΔCt法測定mRNA相對表達水平。相關基因引物序列見表1。

Tab.1 qRT-PCR primer sequence information表1 qRT-PCR引物序列信息

1.2.7 Western blot 檢測巨噬細胞極化表型及軟骨細胞表型 在蛋白樣本中加入含有PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，置于冰上裂解 1 h，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液，并用BCA試劑盒進行蛋白定量。在上清液中加入適量5×SDS 蛋白上樣緩沖液，95 ℃金屬浴煮沸蛋白10 min。配制PAGE 凝膠，在濃縮膠中上樣蛋白30 μg，80 V 電壓30 min，120 V電壓60 min進行蛋白電泳，待溴酚藍跑出分離膠底部即可停止電泳。將PAGE 凝膠轉移到PVDF 膜中，轉膜220 mA 90 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，按蛋白marker 裁剪 PVDF 膜條帶，在 Alix、TSG101、iNOS、Arg-1、MMP-13、β-actin、COLⅡ、TGF-β1 一抗中 4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min 3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗膜10 min 3次。加入ECL發光液，于化學發光顯影系統中觀察。

1.2.8 ELISA 檢測巨噬細胞炎性因子蛋白表達水平 實驗分組同1.2.3。將RAW264.7以1×104個/孔的密度接種于6孔板中，細胞貼壁后，使用20 μg/L 的IFN-γ 刺激RAW264.7 細胞24 h，使其極化為M1Mφ后，棄去培養基，分別更換為含0、10、50 mg/L BMSCs-Exo的完全培養基，繼續培養24 h后收集細胞培養上清液，1 000 r/min 離心 10 min，取上清液，-80 ℃保存。配制蛋白標準品，將樣本和標準品分別加入IL-1β及IL-6 抗體預包被酶標板反應孔中，37 ℃培養箱中孵育90 min，洗板4 次；加入生物素化抗體工作液至反應孔中，孵育60 min后洗板4次；加入酶結合物工作液至反應孔中，孵育30 min后洗板4次；加入顯色液至反應孔中，避光孵育30 min后加入終止液，酶標儀檢測各孔450 nm 處的OD 值，計算出細胞上清中的IL-1β 及IL-6 蛋白表達水平。每組均重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較時方差齊行LSD-t法，方差不齊行Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs-Exo 的提取與表征 透射電鏡觀察到BMSCs-Exo 為圓形囊泡，呈杯狀，為雙層膜結構，粒徑大小約為100 nm，與外泌體結構一致（圖1A）。Western blot 結果示，該囊泡表達外泌體特征蛋白Alix、TSG101，進一步證明收集到的囊泡為BMSCs-Exo（圖1B）。

Fig.1 Identification of BMSCs-Exo圖1 BMSCs-Exo的鑒定

2.2 BMSCs-Exo 對巨噬細胞及軟骨細胞增殖的影響 與24 h 相比，巨噬細胞培養48 h 后細胞數目增加，且50 mg/L Exo 組細胞數目最多，見表2。模型組中的IL-1β 明顯抑制了軟骨細胞的增殖，而加入50 mg/L Exo處理后，IL-1β的抑制作用減輕，細胞增殖較模型組明顯，見表3。以上結果證明BMSCs-Exo具有良好的生物相容性，能促進細胞增殖。

Tab.2 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on macrophages for 24 h and 48 h表2 BMSC-Exos對巨噬細胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

Tab.2 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on macrophages for 24 h and 48 h表2 BMSC-Exos對巨噬細胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與 10 mg/L Exo 組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F 24 h 1.15±0.13 1.21±0.09 1.58±0.07ab 21.660＊＊1.40±0.06 1.42±0.08 2.77±0.10ab 385.945＊＊48 h t 3.528＊3.684＊19.358＊＊

Tab.3 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on chondrocytes for 24 h and 48 h表3 BMSC-Exos對軟骨細胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

Tab.3 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on chondrocytes for 24 h and 48 h表3 BMSC-Exos對軟骨細胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與IL-1β+10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組IL-1β+10 mg/L Exo組IL-1β+50 mg/L Exo組F 24 h 1.63±0.07 0.30±0.04a 0.49±0.07ab 1.42±0.06abc 504.518＊＊48 h 3.01±0.12 0.40±0.15a 0.52±0.11a 1.77±0.16abc 324.883＊＊t 20.173＊＊1.306 0.494 3.958＊＊

2.3 BMSCs-Exo 對巨噬細胞形態的影響 未對巨噬細胞進行干預時，細胞形態較圓，生長狀態良好，呈團狀聚集（圖2A）。使用20μg/L IFN-γ 刺激24 h后，iNOS 表達水平升高，Arg-1 表達水平降低，證明巨噬細胞細胞極化為M1Mφ，見表4，且細胞呈不規則形態，可見偽足（圖2B）。Mφ在極化為M1Mφ后，使用不同劑量的BMSCs-Exo 對M1型巨噬細胞進行干預。BMSCs-Exo 為10 mg/L 時，細胞形態發生改變，細胞變圓，但仍可見部分有偽足細胞（圖2C）；50 mg/L時，基本無分化細胞，細胞形態較圓，細胞密集（圖2D）。

Fig.2 Macrophage cell morphology of different treatment groups(Scale bar represents 100μm)圖2 不同處理組巨噬細胞形態（標尺=100μm）

Tab.4 Comparison of mRNA levels of M1/M2 macrophage-related markers after IFN-γ stimulation表4 IFN-γ刺激后M1/M2巨噬細胞相關標志物的mRNA水平比較 （n=3，）

Tab.4 Comparison of mRNA levels of M1/M2 macrophage-related markers after IFN-γ stimulation表4 IFN-γ刺激后M1/M2巨噬細胞相關標志物的mRNA水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組20μg/L IFN-γ組t mRNA水平iNOS 1.02±0.09 2.48±0.74 3.368＊Arg-1 1.00±0.09 0.27±0.05 11.778＊＊

2.4 BMSCs-Exo 對巨噬細胞表型極化的調控作用 與對照組相比，10 mg/L 和50 mg/L BMSCs-Exo處理組的M1表型相關蛋白iNOS的表達降低；而M2表型相關蛋白Arg-1 表達增多，50 mg/L Exo 組的Arg-1表達量顯著增多，見圖3、表5。mRNA 檢測結果顯示，與對照組相比，BMSCs-Exo 的處理可降低M1表型相關基因iNOS的表達，升高M2表型相關基因Arg-1 的表達水平，與Western blot 的結果趨勢一致，見表5。BMSCs-Exo 具有調控巨噬細胞表型極化的作用，可促M1向M2表型極化。

Fig.3 Macrophage phenotypic polarization圖3 巨噬細胞表型極化

Tab.5 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on expression levels of phenotypeassociated markers in M1/M2 macrophages表5 不同劑量BMSCs-Exo對M1/M2巨噬細胞表型相關標志物表達水平的調控作用比較（n=3，）

Tab.5 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on expression levels of phenotypeassociated markers in M1/M2 macrophages表5 不同劑量BMSCs-Exo對M1/M2巨噬細胞表型相關標志物表達水平的調控作用比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F mRNA水平Arg-1 1.03±0.29 1.24±0.28 3.24±0.35ab 46.755＊＊iNOS 1.00±0.12 0.46±0.02a 0.26±0.03ab 87.323＊＊蛋白水平Arg-1 0.18±0.02 0.30±0.04a 0.88±0.04ab 382.243＊＊iNOS 1.05±0.08 0.54±0.03a 0.47±0.07a 75.789＊＊

2.5 BMSCs-Exo 對炎性因子表達的調控 與對照組相比，BMSCs-Exo 處理組的炎性因子IL-1β、IL-6的 mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），見表 6。ELISA檢測結果顯示，對照組細胞培養上清液中IL-1β 及 IL-6 的蛋白表達水平較高，50 mg/L BMSCs-Exo 處理可降低IL-1β及IL-6的蛋白表達水平（P＜0.05），見表7。

Tab.6 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of inflammatory factors in macrophages表6 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細胞炎性因子mRNA水平的調控作用比較 （n=3，）

Tab.6 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of inflammatory factors in macrophages表6 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細胞炎性因子mRNA水平的調控作用比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F IL-1β 1.00±0.07 0.31±0.02a 0.22±0.04a 231.825＊＊IL-6 1.00±0.04 0.45±0.10a 0.35±0.09a 60.248＊＊

Tab.7 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of inflammatory factor proteins in macrophages表7 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細胞炎性因子蛋白表達水平的調控作用比較 （n=3，ng/L，）

Tab.7 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of inflammatory factor proteins in macrophages表7 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細胞炎性因子蛋白表達水平的調控作用比較 （n=3，ng/L，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與 10 mg/L Exo 組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F IL-1β 27.81±8.84 26.88±6.80 12.11±3.27ab 5.169＊IL-6 7.25±1.25 2.03±1.05a 3.04±1.40a 14.877＊＊

2.6 BMSCs-Exo 對炎癥軟骨細胞的調控 與模型組相比，BMSCs-Exo 處理組的軟骨細胞成軟骨相關蛋白COLⅡ及TGF-β1 表達明顯升高，而MMP-13表達顯著降低，見圖4、表8。mRNA 水平結果顯示，IL-1β 刺激抑制了COL2a1、TGF-β1 的mRNA 表達，并升高MMP-13 mRNA 的表達水平，而50 mg/L BMSCs-Exo 處理組的 COL2a1、TGF-β1 的 mRNA 表達水平則顯著高于模型組，見表9。

Fig.4 Expression levels of chondrogenesis-related proteins圖4 成軟骨相關蛋白的表達水平

Tab.8 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of chondrogenic-related proteins in chondrocytes表8 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細胞成軟骨相關蛋白表達水平的調控作用比較 （n=3，）

Tab.8 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of chondrogenic-related proteins in chondrocytes表8 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細胞成軟骨相關蛋白表達水平的調控作用比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與IL-1β+10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組IL-1β+10 mg/L Exo組IL-1β+50 mg/L Exo組F COLⅡ0.54±0.02 0.31±0.01a 0.75±0.02ab 0.90±0.05ab 245.833＊＊TGF-β1 0.97±0.04 0.40±0.02a 0.60±0.03ab 0.76±0.04abc 138.065＊＊MMP-13 0.16±0.01 0.43±0.02a 0.18±0.01b 0.16±0.01b 379.851＊＊

Tab.9 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of chondrogenesis-related genes in chondrocytes表9 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細胞成軟骨相關基因mRNA表達水平的調控作用比較（n=3，）

Tab.9 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of chondrogenesis-related genes in chondrocytes表9 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細胞成軟骨相關基因mRNA表達水平的調控作用比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與IL-1β+10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組IL-1β+10 mg/L Exo組IL-1β+50 mg/L Exo組F COL2a1 1.00±0.11 0.62±0.01 1.40±0.10ab 2.15±0.30ab 45.791＊＊TGF-β1 1.00±0.08 0.25±0.04a 0.53±0.05ab 2.11±0.31bc 74.902＊＊MMP-13 1.00±0.02 8.24±0.15a 6.90±0.46a 3.11±0.24abc 456.037＊＊

3 討論

3.1 治療TMJ-OA 的骨軟骨組織工程策略 TMJOA 病理機制復雜，涉及軟骨退變、滑膜炎癥等［9］?，F階段TMJ-OA的治療方法主要分為保守治療與手術治療，但均存在局限性。保守治療僅能緩解局部癥狀，手術治療具有免疫排斥等風險［10］。因此，開發新的治療手段是目前TMJ-OA 領域亟需解決的難題。

組織工程是一種以實現受損組織結構和功能再生的新興治療技術，其中，MSCs 是研究較為深入的組織工程種子細胞［11］。盡管干細胞療法在再生醫學中具有良好的前景，但目前干細胞的臨床應用仍存有爭議［12］。BMSCs-Exo 具有與 BMSCs 相似的功能特性，與干細胞療法相比，Exo避免了干細胞應用中的倫理及腫瘤發生等問題，更易對靶細胞進行調控，被認為是干細胞療法的替代［13］。MSCs 衍生的Exo可通過調節免疫系統、刺激細胞增殖等發揮治療作用［14］?；诖?，本研究提取了BMSCs-Exo，通過體外實驗探索了其對Mφ表型極化的影響及在炎癥微環境中發揮的免疫調控作用；結果顯示，所收集的囊泡具有雙層膜結構，表達外泌體特征性表面蛋白，并且BMSCs-Exo 具有良好的生物相容性，可促進巨噬細胞及軟骨細胞增殖。

3.2 BMSCs-Exo可極化Mφ表型及維持軟骨細胞表型 Mφ 是骨關節滑膜液中主要的免疫細胞，在TMJ-OA 的發病機制中發揮著重要的作用［15］。Mφ易受微環境刺激，M1Mφ 可釋放高水平的促炎因子IL-1β、IL-6等，促進炎癥的發生發展；M2Mφ可產生抗炎因子IL-1α、Arg-1 等，緩解炎癥反應并促進組織修復再生［6］。本研究結果顯示，當巨噬細胞極化為M1Mφ，經BMSCs-Exo 處理后，M1Mφ 中高表達的iNOS 表達水平降低，50 mg/L BMSCs-Exo 與 10 mg/L BMSCs-Exo 相比，可更明顯下調iNOS 的表達，并顯著上調M2Mφ相關蛋白Arg-1的表達水平。

M1Mφ 和M2Mφ 之間的平衡與TMJ-OA 的嚴重程度相關［7］。在OA 患者的滑膜液中可檢測到高水平促炎因子和大量的M1Mφ。已有研究證明，通過改變 M1Mφ/M2Mφ 比例可有效緩解炎癥反應［16］。Kim等［17］發現，M2Mφ衍生的外泌體可以將M1Mφ重編程為M2Mφ，達到抗炎及促進皮膚傷口愈合的目的。Zheng 等［18］報道了原代軟骨細胞衍生的外泌體可以增加M2Mφ 的浸潤，減少M1Mφ 的數量，抑制OA 的發展。本研究中，50 mg/L BMSCs-Exo 能顯著誘導 M1Mφ 高表達M2Mφ 表型相關基因，BMSCs-Exo具有調控M1Mφ向M2Mφ極化的能力，與上述報道一致。

TGF-β1可促進軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原聚集和蛋白聚糖的分泌［19］，并導致Smad2磷酸化，進而上調軟骨標志物Col2a1、Sox9、Acan表達水平以促進軟骨生成［20］。本研究中也發現了BMSCs-Exo 在炎癥軟骨細胞中具有一致的效果，進一步證實了BMSCs-Exo 在炎癥微環境中可促進軟骨細胞增殖，維持軟骨細胞表型，具有促進軟骨修復的作用。筆者通過觀察BMSCs-Exo 對炎癥軟骨細胞的調控發現，BMSCs-Exo 處理能減少IL-1β 對TGF-β1 的抑制作用，降低MMP-13 表達，升高COL2a1 表達水平。本研究證明了在炎癥的免疫調節過程中，Mφ極化與炎性因子表達有關，BMSCs-Exo處理后的M1Mφ中，極化表型可發生改變，IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 表達水平下調，有助于降低炎癥微環境中的炎性因子水平，同時可促進炎癥微環境中的軟骨修復。

綜上所述，BMSCs-Exo 可通過調控Mφ 的表型極化，降低炎性因子表達水平，同時促進炎癥微環境中的軟骨修復，為探索BMSCs-Exo 緩解TMJ-OA 和參與組織再生的機制提供了新的思路與方向。BMSCs-Exo對TMJ-OA的作用及其更深入的機制還有待于更進一步的研究發現。