lncRNA IGF2-AS調控IGF2對骨髓間充質干細胞心肌樣分化的影響

鐘曉鳴，劉洪洋，張蕾，姚新亮，魯雪莉，許瑾瑾，程冠昌

基于細胞的心肌修復和再生療法是目前治療心力衰竭和缺血性心臟病的一種有潛力的療法［1］。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種骨髓來源的非造血干細胞，具有自我更新和多能分化的潛力，可以分化為心肌細胞來修復受損的心肌，從而改善心臟功能，這種基于細胞的療法對于心肌修復和再生具有重要意義［2］。使用5-氮雜胞嘧啶（5-azacytidine，5-AZA）在體外將BMSCs 誘導為心肌細胞是一種較為傳統的方法，但5-AZA 會引起細胞損傷［3］。因此，尋找一種安全的誘導BMSCs 向心肌細胞分化的方法至關重要。有文獻報道，長鏈非編碼RNA 胰島素樣生長因子2反義轉錄物（long non-coding RNA insulin-like growth factor 2 antisense transcript，lncRNA IGF2-AS）可促進牛成肌細胞分化［4］，IGF2-AS 能以表觀遺傳DNA甲基轉移酶1依賴性的方式調控有義同源基因胰島素樣生長因子2（IGF2）的表達［5］。但lncRNA IGF2-AS 對BMSCs 心肌樣分化的影響以及能否通過調控IGF2影響BMSCs心肌樣分化尚鮮見報道。因此，本研究主要探究lncRNA IGF2-AS 對BMSCs 心肌樣分化的影響并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3 周齡體質量 20～30 g 的 6 只 SPF 級雄性SD 大鼠購自廣州賽業百沐生物科技有限公司，生產許可證號SCXK（粵）2020-0055。所有動物實驗均得到本院動物倫理委員會的批準，并遵循3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器 pLVX-IRES-Zs Green1 載體、si-IGF2-AS、si-IGF2 及 si-IGF2-AS 和 si-IGF2 的陰性對照 si-NC 均購自廣州萊德爾生物科技有限公司；pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS 質粒由廣州基迪奧生物科技有限公司合成；胎牛血清（FBS）、低糖DMEM培養基、LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自上海西格生物科技有限公司；5-AZA購自湖北漢達飛生物科技有限公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司；Pierce? Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit 購自上海創賽科技有限公司；MTT試劑盒、RNA免疫沉淀（RIP）試劑盒購自廣州賽誠生物科技有限公司；大鼠CD29-PE、CD90-PE-CyTM7、CD45-FITC 抗體購自美國 BD 公司；IGF2、間隙連接蛋白43（Cx43）、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、β-actin 兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗均購自廣州復能基因有限公司；ECL化學發光試劑盒、BCA試劑盒均購自鄭州金圖生物科技有限公司；CO2培養箱購自上海旦鼎國際貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs的分離與培養 參考文獻［6］進行BMSCs的分離與培養。將大鼠脫頸處死后置于75%乙醇中浸泡10 min，在超凈臺中分離四肢長骨，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，剪掉骨骺端露出骨髓腔，利用無血清培養基將骨髓沖至15 mL離心管中，離心，棄上清液，利用含有10%FBS的低糖DMEM培養基懸浮細胞后接種于細胞培養瓶中，在37 ℃、5%CO2培養箱中進行常規傳代培養，傳代至第3代時用于后續實驗，并利用倒置顯微鏡觀察原代細胞、第3代細胞的形態。

1.2.2 BMSCs 表面抗原的鑒定 取第3 代生長狀態良好的BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后用PBS洗滌3次，在常溫下以1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入PBS 重懸細胞，并調整細胞濃度為1×107個/mL，分為6個試管，每管加入100μL細胞懸液，并分別加入CD29-PE、CD90-PE-CyTM7、CD45-FITC及其對應的同型對照抗體，4 ℃下避光孵育20 min，在常溫下以1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入500 μL PBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測BMSCs 表面抗原CD29、CD90、CD45的表達。

1.2.3 細胞分組 利用瞬時轉染技術進行轉染，并將第3代生長良好的BMSCs 分為對照組（未做任何處理）、空載體組（轉染pLVX-IRES-Zs Green1 載體）、lncRNA IGF2-AS 組（轉染pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS）、5-AZA組（8μmol/L 5-AZA 處理）、si-NC 組（轉染si-NC）、si-IGF2-AS 組（轉染si-IGF2-AS）、si-IGF2 組（轉染si-IGF2）、lncRNA IGF2-AS+si-NC 組（pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS 與 si-NC 共轉染）、lncRNA IGF2-AS+si-IGF2 組（pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS與si-IGF2共轉染）。轉染48 h后，用于后續實驗。

1.2.4 qRT-PCR 檢 測 IGF2-AS mRNA 表達 使用 TRIzol 試劑從各組細胞中分離總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。所有反應均在20μL 反應體系中進行，PCR 反應條件：95 ℃10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃15 s，40 個循環。以GAPDH 為內參，利用 2-ΔΔCt法分析 IGF2-AS 的相對表達量。IGF2-AS 引物序列：上游5'-CCCCTGACCAAGAGACCAAC-3'，下游 5'-TGAAATGGTACGACAGCGGC-3'。GAPDH 引物序列：上游5'-CACTGAGGACCAGGTTGTCT-3'，下游5'-TGTCGTACCAGGAAATGAGC-3'。

1.2.5 MTT 法檢測細胞活力 收集各組細胞并調整細胞濃度為6×107/L，分別取100 μL 加入到96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，棄上清液，加入80μL低糖DMEM培養液，再加入20μL MTT溶液繼續孵育4 h，棄上清液，每孔加入150μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。利用酶標儀測量490 nm處的光密度（OD）。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達 利用預冷的RIPA裂解緩沖液提取各組細胞中的蛋白質，使用BCA試劑盒評估蛋白質濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離總蛋白（30μg）。分離的蛋白質被轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入一抗IGF2（1∶2 000）、Cx43（1∶2 000）、cTnT（1∶1 000）、cTnI（1∶1 000）、β-actin（1∶1 500），在4 ℃下孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，再加入HRP偶聯的羊抗兔二抗（1∶1 000），于室溫下孵育1 h，通過ECL化學發光試劑盒檢測蛋白質水平，以β-actin為內參，使用Image J軟件量化蛋白質條帶。

1.2.7 RNA 下拉檢測 利用Pierce?Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit 進行RNA 下拉檢測。將生物素化的NC 和IGF2-AS分別轉染到BMSCs中。48 h后，將細胞裂解液與鏈酶親和素標記的磁珠混合形成蛋白質-生物/RNA-磁珠復合物，用高鹽洗脫得到蛋白質-生物/RNA 復合物，分別命名為bio-NC組、bio-IGF2-AS組，以Input作為陽性對照。最后，通過Western blot檢測IGF2在蛋白質-生物/RNA混合物中的相對表達。

1.2.8 RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）法檢測 IGF2-AS 與IGF2蛋白結合 利用RIP試劑盒進行RIP分析。在RIP裂解緩沖液中裂解細胞，利用蛋白A/G磁珠對IGF2抗體進行免疫沉淀，用磁鐵固定與復合物結合的磁珠并洗掉未結合的材料，提取RNA進行qRT-PCR分析IGF2-AS的相對表達量，免疫球蛋白G（IgG）作對照參考。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較行SNK-q檢驗，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 形態學觀察及表面抗原鑒定 原代細胞在培養初期呈懸浮狀，大多數呈圓形，培養48 h后開始貼壁生長；第3 代細胞呈長梭形，排列不整齊，相鄰細胞間緊密連接，呈成纖維細胞樣，見圖1。流式細胞術鑒定結果顯示，第3代BMSCs高表達CD29（98.21%）、CD90（92.54%），低表達CD45（3.67%），見圖2。

Fig. 1 Morphology of BMSCs observed by inverted microscope(×400)圖1 倒置顯微鏡觀察BMSCs形態（×400）

Fig. 2 Detection of surface antigens CD29,CD90 and CD45 of BMSCs by flow cytometry圖2 流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD45

2.2 過表達IGF2-AS對BMSCs中IGF2-AS表達、心肌樣分化及細胞活力的影響 與對照組、空載體組相 比 ，lncRNA IGF2-AS 組 、5-AZA 組 BMSCs 中IGF2-AS mRNA 表達，Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與lncRNA IGF2-AS 組相比，5-AZA 組 BMSCs 中 IGF2-AS mRNA 表達，Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與對照組相比，空載體組、lncRNA IGF2-AS 組、5-AZA 組細胞活力（OD 值）顯著降低，且5-AZA 組細胞活力明顯低于lncRNA IGF2-AS組，見圖3、表1。

Fig.3 Effects of overexpression of IGF2-AS on the expression of Cx43,cTnT and cTnI proteins in BMSCs detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測過表達IGF2-AS對BMSCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達的影響

Tab.1 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by overexpression of IGF2-AS表1 過表達IGF2-AS對各組IGF2-AS mRNA表達、心肌樣分化及細胞活力比較 （n=6，）

Tab.1 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by overexpression of IGF2-AS表1 過表達IGF2-AS對各組IGF2-AS mRNA表達、心肌樣分化及細胞活力比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與空載體組比較，c與lncRNA IGF2-AS組比較，P＜0.05。

組別對照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組F IGF2-AS mRNA 1.02±0.14 1.04±0.12 2.46±0.17ab 1.68±0.17abc 120.784＊＊Cx43/β-actin 0.41±0.03 0.45±0.04 1.72±0.16ab 1.49±0.09abc 311.133＊＊組別對照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組F cTnT/β-actin 0.62±0.04 0.66±0.05 2.03±0.25ab 1.71±0.14abc 145.234＊＊cTnI/β-actin 0.29±0.01 0.31±0.02 1.25±0.13ab 0.89±0.11abc 178.414＊＊OD490 1.27±0.12 1.06±0.11a 1.03±0.14a 0.82±0.07abc 15.953＊＊

2.3 沉默IGF2-AS對BMSCs中IGF2-AS表達、心肌樣分化及細胞活力的影響 與對照組、si-NC 組相比，si-IGF2-AS 組 BMSCs 中 IGF2-AS mRNA 表達，Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達顯著降低，5-AZA 組BMSCs 中 IGF2-AS mRNA 表達，Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。與對照組相比，si-NC組、si-IGF2-AS 組、5-AZA 組細胞活力顯著降低，且5-AZA 組細胞活力明顯低于si-IGF2-AS 組，見圖4、表2。

Fig.4 Effects of silencing IGF2-AS on the expression of Cx43,cTnT and cTnI proteins in BMSCs detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測沉默IGF2-AS對BMSCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達的影響SCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達的影響

Tab.2 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by silencing IGF2-AS表2 沉默IGF2-AS對各組IGF2-AS mRNA表達、心肌樣分化及細胞活力比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by silencing IGF2-AS表2 沉默IGF2-AS對各組IGF2-AS mRNA表達、心肌樣分化及細胞活力比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與si-NC 組比較，c與si-IGF2-AS 組比較，P＜0.05。

組別對照組si-NC組si-IGF2-AS組5-AZA組F IGF2-AS mRNA 1.03±0.12 1.01±0.13 0.42±0.03ab 1.66±0.12abc 132.086＊＊Cx43/β-actin 0.43±0.04 0.46±0.03 0.15±0.01ab 1.48±0.06abc 1 318.452＊＊組別對照組si-NC組si-IGF2-AS組5-AZA組F cTnT/β-actin 0.65±0.06 0.68±0.07 0.27±0.02ab 1.73±0.14abc 330.800＊＊cTnI/β-actin 0.32±0.02 0.34±0.01 0.11±0.01ab 0.86±0.06abc 581.857＊＊OD490 1.29±0.13 1.05±0.10a 1.02±0.12a 0.84±0.08abc 17.208＊＊

2.4 IGF2-AS 上調IGF2 表達 通過生物信息數據庫發現IGF2-AS 為IGF2 的反義轉錄本。Western blot 結果顯示，與對照組、空載體組相比，lncRNA IGF2-AS 組細胞中IGF2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖5。與對照組、si-NC組相比，si-IGF2-AS組細胞中IGF2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖6。RNA下拉實驗和RIP實驗結果表明，IGF2-AS能與IGF2蛋白相互作用，見圖7、8。

Fig.5 Effects of overexpression of IGF2-AS on IGF2 protein expression in BMSCs detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測過表達IGF2-AS對BMSCs中IGF2蛋白表達的影響

Fig.6 Effects of silencing IGF2-AS on IGF2 protein expression in BMSCs detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測沉默IGF2-AS對BMSCs中IGF2蛋白表達的影響

Fig.7 RNA pull-down experiment proved that IGF2 combined with IGF2-AS圖7 RNA下拉實驗證明IGF2與IGF2-AS結合

Fig.8 The interaction between IGF2-AS and IGF2 protein verified by RIP experiment圖8 RIP實驗驗證IGF2-AS與IGF2蛋白相互作用

2.5 沉默 IGF2 對 BMSCs 中 IGF2 蛋白、心肌樣分化及細胞活力的影響 與對照組、si-NC 組相比，si-IGF2組BMSCs中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達顯著降低，5-AZA 組BMSCs 中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。與對照組相比，si-NC 組、si-IGF2 組、5-AZA 組細胞活力顯著降低，且5-AZA 組細胞活力明顯低于si-IGF2 組，見圖9、表3。

Fig.9 Effects of silencing IGF2 on protein expressions of IGF2,Cx43,cTnT and cTnI in BMSCs detected by Western blot assay圖9 Western blot檢測沉默IGF2對BMSCs中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達的影響

Tab.3 Comparison of IGF2 protein,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups表3 各組IGF2蛋白、心肌樣分化及細胞活力比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of IGF2 protein,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups表3 各組IGF2蛋白、心肌樣分化及細胞活力比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與si-NC組比較，c與si-IGF2組比較，P＜0.05。

組別對照組si-NC組si-IGF2組5-AZA組F IGF2/β-actin 0.69±0.05 0.72±0.07 0.34±0.02ab 1.11±0.15abc 78.495＊＊Cx43/β-actin 0.45±0.03 0.47±0.05 0.14±0.01ab 1.42±0.09abc 635.724＊＊cTnT/β-actin 0.66±0.04 0.69±0.05 0.26±0.03ab 1.68±0.15abc 318.741＊＊cTnI/β-actin 0.35±0.01 0.37±0.02 0.12±0.01ab 0.79±0.06abc 445.095＊＊OD490 1.27±0.11 1.02±0.08a 1.01±0.09a 0.80±0.05abc 30.488＊＊

2.6 沉默 IGF2 逆轉了過表達 IGF2-AS 對 BMSCs 心肌樣分化的促進作用 與對照組、空載體組相比，lncRNA IGF2-AS 組 、5-AZA 組 BMSCs 中 IGF2、Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達顯著升高，且 lncRNA IGF2-AS組相應指標明顯高于5-AZA組（P＜0.05）；與 lncRNA IGF2-AS 組、lncRNA IGF2-AS+si-NC 組相比，lncRNA IGF2-AS+si-IGF2 組 BMSCs 中 IGF2、Cx43、cTnT、cTnI 蛋白顯著降低，但相應指標均高于對照組、空載體組（P＜0.05），見圖10、表4。

Fig.10 Effects of silencing IGF2 and overexpression of IGF2-AS on the protein expressions of IGF2,Cx43,cTnT and cTnI in BMSCs detected by Western blot assay圖10 Western blot檢測沉默IGF2及過表達IGF2-AS對BMSCs中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達的影響

Tab.4 Comparison of IGF2 protein and cardiomyocytelike differentiation between the six groups表4 各組IGF2蛋白及心肌樣分化比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of IGF2 protein and cardiomyocytelike differentiation between the six groups表4 各組IGF2蛋白及心肌樣分化比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與空載體組比較，c與lncRNA IGF2-AS組比較，d與lncRNA IGF2-AS+si-NC組比較，P＜0.05。

組別對照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組lncRNA IGF2-AS+si-NC組lncRNA IGF2-AS+si-IGF2組F IGF2/β-actin 0.66±0.04 0.67±0.05 1.68±0.14ab 1.36±0.14abc 1.71±0.15 1.17±0.13abcd 94.817＊＊Cx43/β-actin 0.44±0.02 0.47±0.05 1.78±0.19ab 1.53±0.08abc 1.81±0.22 0.86±0.07abcd 147.902＊＊組別對照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組lncRNA IGF2-AS+si-NC組lncRNA IGF2-AS+si-IGF2組F cTnT/β-actin 0.64±0.05 0.67±0.06 2.08±0.21ab 1.75±0.12abc 2.12±0.23 0.95±0.08abcd 140.065＊＊cTnI/β-actin 0.27±0.02 0.29±0.01 1.28±0.12ab 0.92±0.12abc 1.26±0.11 0.61±0.05abcd 168.713＊＊

3 討論

3.1 BMSCs 的成功分離 近年來急性心肌梗死的發生率呈逐漸上升的趨勢，該病發生過程中會導致心肌細胞喪失，嚴重影響人類健康［7］。BMSCs 移植是一種可行的方法，其通過分化為心肌細胞來修復缺血心肌，從而逆轉心臟重塑、減輕心臟纖維化并改善心臟功能［8］。然而目前誘導BMSCs向心肌細胞分化的效率較低，成為影響BMSCs 移植療效的因素之一［9］。有文獻報道，大多數BMSCs 高表達細胞表面抗原CD29、CD90、CD44，低表達CD34、CD45［10］。本研究發現，第3代BMSCs細胞呈長梭形，相鄰細胞間呈纖維細胞樣，且高表達CD29、CD90，低表達CD45，表明從大鼠中成功分離BMSCs。

3.2 過表達IGF2-AS 可以促進BMSCs 心肌樣分化 lncRNA 是一類非編碼RNA，包含200多個核苷酸。其在表觀遺傳、轉錄和轉錄后等多個層面調節基因表達，廣泛參與機體的生理與病理過程［11］。lncRNA IGF2-AS 是IGF2 的反義轉錄物，其通過調節 miR-3、126-5p/KLK4 軸增 強 BMSCs 的 成 骨 分化［12］；IGF2-AS在小鼠成肌細胞中高表達，并參與肌管的形成［13］，表明lncRNA IGF2-AS可參與細胞分化過程。但關于IGF2-AS 對BMSCs 心肌樣分化的影響尚不明確。Cx43 是心肌細胞中最常見的連接蛋白，其正常表達是心臟正常活動及協調收縮與舒張的重要保證［14］。cTnT 在心肌組織中具有組織特異性，其高表達代表BMSCs已向心肌細胞分化［15］。在心肌收縮過程中，cTnI具有調節粗、細肌絲間的相對滑行的作用［16］。本研究結果顯示，過表達IGF2-AS或 5-AZA 處理均可促進 BMSCs 中 Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達，且lncRNA IGF2-AS組細胞活力明顯高于5-AZA 組 ；沉 默 IGF2-AS 可抑 制 BMSCs 中 Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達，表明 IGF2-AS 轉染或 5-AZA處理均可促進BMSCs 心肌樣分化，且利用IGF2-AS轉染引起的細胞損傷更輕，效果更佳。

3.3 過表達lncRNA IGF2-AS 通過上調IGF2 促進BMSCs心肌樣分化 IGF2是位于7號染色體上的印跡基因，其可促進牛成肌細胞的分化［17］，在小鼠胚胎干細胞定向分化為胰島樣細胞過程中高表達［18］，且可增強來自根尖乳頭的干細胞的成骨分化潛能［19］。本研究發現IGF2-AS 為IGF2 的反義轉錄本。有研究顯示，反義轉錄物可以調節其有義鏈基因的轉錄和翻譯［20］。推測 IGF2-AS 可能通過調控 IGF2 影響BMSCs 心肌樣分化。為了驗證該推測，本研究通過Western blot發現，過表達IGF2-AS可促進IGF2蛋白表達，沉默IGF2-AS 可抑制IGF2 蛋白表達，表明IGF2-AS 可能正向調控IGF2 的表達。為進一步驗證該假設，本研究利用RNA 下拉和RIP 實驗證實IGF2-AS能與IGF2蛋白相互作用，沉默IGF2逆轉了過表達IGF2-AS 對BMSCs 心肌樣分化的促進作用，最終證明了過表達lncRNA IGF2-AS 可通過上調IGF2促進BMSCs心肌樣分化。因此，本研究為尋找高效誘導BMSCs 心肌樣分化的方法提供了新的思路。