木犀草素抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷作用的研究

呂明義，鄧淑玲，郭文晏，邱永升，龍曉鳳△

缺血再灌注損傷是指機(jī)體組織、器官血流供應(yīng)短暫性障礙后再次使血流恢復(fù)灌注時(shí)所發(fā)生的炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等病理過程，雖然在缺血早期階段及時(shí)進(jìn)行再灌注治療可使疾病進(jìn)展得到有效控制，但組織、器官損傷仍然無法完全避免［1］。腦缺血再灌注損傷在各類缺血再灌注損傷中具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高等特點(diǎn)，危害尤為嚴(yán)重［2］。因此，尋找腦缺血后有效的保護(hù)藥物，進(jìn)而延緩病情進(jìn)展，改善神經(jīng)功能，已成為近年來的研究熱點(diǎn)［3］。

木犀草素廣泛存在于胡蘿卜、椰菜、甜菜、菜花、洋白菜、芽甘藍(lán)和百里香等蔬菜中，還存在于白毛夏枯草、菊花、荊芥和金銀花等傳統(tǒng)藥用植物中，為食源性黃酮類化合物［4］。木犀草素具有保護(hù)心腦血管、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［5］。喬會(huì)敏等［6］研究表明，木犀草素可以通過抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）的表達(dá)對(duì)腦組織損傷起到保護(hù)作用。方露玫等［7］研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠通過增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞膜上的鈉泵活性，減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)元損傷。此外，也有研究提示，木犀草素對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與促進(jìn)氧化/抗氧化狀態(tài)的再平衡有關(guān)［8］。

目前木犀草素保護(hù)腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制并未闡述清楚。本研究建立了大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，在明確木犀草素減輕腦缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)上，探討其對(duì)炎癥反應(yīng)和凋亡的影響，并進(jìn)一步研究兩者與Janus 蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）信號(hào)通路的關(guān)系，為木犀草素應(yīng)用于腦缺血再灌注損傷的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠120只，平均體質(zhì)量（200±20）g，SPF 級(jí)，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。

1.2 主要試劑與儀器 木犀草素（HPLC≥98%，南京春秋生物公司）；尼莫地平片（30 mg/片，湖南百草制藥公司）；2，3，5-三苯基氯化銨（TTC，上海尚寶生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、B 細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、白細(xì)胞介素（IL）-6、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、IL-1β 及半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（武漢博士德公司）；ECL 發(fā)光試劑盒（上海翌圣生物科技公司）。線栓（型號(hào)3600，廣州佳靈生物公司），電子天平（型號(hào)AL204IC，瑞士梅特勒-托利多儀器公司），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)PrimoR，美國ThermoFisher公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)ChemiDoc XRS+）、酶標(biāo)儀（型號(hào)680）、垂直電泳儀（型號(hào)Mini-PROTEAN Tetra）均購自美國Bio-Rad 公司，切片機(jī)（型號(hào)RM2235，德國Leica 公司）；顯微鏡（型號(hào)BX61，日本Olympus公司）。

1.3 分組、給藥及MCAO模型建立 將飼養(yǎng)3 d的SD大鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、MCAO 組、木犀草素低劑量組（50 mg/kg）、木犀草素高劑量組（100 mg/kg）及尼莫地平組（15 mg/kg），每組24 只。大鼠均灌胃給藥，灌胃體積均為20 mL/kg，頻率為1 次/d，共7 d；假手術(shù)組及MCAO 組用同體積溶媒（0.5%羧甲基纖維素鈉）灌胃。末次給藥24 h后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，于頸部正中偏左處用眼科剪剪口，將左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）逐層分離，并分離頸外動(dòng)脈（ECA），結(jié)扎ECA及CCA近心端，CCA遠(yuǎn)心端輕打一個(gè)線栓能穿過的小結(jié)。在CCA距離分叉約5 mm處剪開一個(gè)約0.2 mm大小的缺口，插入線栓，經(jīng)CCA分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈；當(dāng)有阻力時(shí)（插入線栓長度約為18～20 mm），即阻斷大腦中動(dòng)脈入口處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端；2 h后將線栓抽出，進(jìn)行缺血后再灌注，建立MCAO大鼠模型；假手術(shù)組不做插線處理，僅暴露CCA。

1.4 神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦組織含水量檢測 神經(jīng)功能損傷評(píng)分按照Bederson 等［9］的方法進(jìn)行，0 分為無任何神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為身體不轉(zhuǎn)圈，但前爪屈曲對(duì)側(cè)壓有抵抗；3分為身體向左側(cè)方向轉(zhuǎn)圈，且伴有前爪屈曲對(duì)側(cè)壓有抵抗。腦組織含水量檢測用干濕重法進(jìn)行。

1.5 TTC 染色 再灌注24 h后，各組按隨機(jī)數(shù)字表法抽取8只大鼠，采用TTC染色法檢測腦梗死體積。大鼠腦組織進(jìn)行連續(xù)冠狀切片（1 mm），在37 ℃條件下放入2%TTC溶液中，浸泡15 min；隨后，在4%多聚甲醛溶液中固定。經(jīng)TTC 染色后，未梗死區(qū)域仍呈紅色，而梗死區(qū)域呈白色，腦梗死體積檢測采用Image J軟件進(jìn)行。

1.6 ELISA 檢測 各組大鼠麻醉后斷頭取腦，準(zhǔn)確稱質(zhì)量；按照質(zhì)量（g）與體積（mL）比為1∶9的比例加入預(yù)冷的組織裂解液，勻漿，12 000 r/min離心15 min，制備10%腦組織勻漿液，分裝后于冰箱中保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書中的檢測步驟，進(jìn)行TNF-α、IL-6、IL-1β、Bcl-2、Bax及Caspase-3含量檢測。

1.7 Western blot 檢測 取1.6制備的腦組織勻漿液，BCA法測總蛋白含量。加入上樣緩沖液，沸水中煮5 min 使蛋白變性，每孔上樣20μg蛋白樣品。常規(guī)行12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。室溫下經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，加入JAK2（1∶1 000 倍稀釋）、p-JAK2（1∶500 倍稀釋）、STAT3（1∶1 000倍稀釋）、p-STAT3（1∶500 倍稀釋）及內(nèi)參蛋白GAPDH（1∶1 000倍稀釋）抗體，4 ℃孵育過夜。在室溫下，再經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗孵育0.5 h，ECL法顯色并曝光，進(jìn)行圖像掃描分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦組織含水量比較 MCAO組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦組織含水量比假手術(shù)組明顯增加（P＜0.05），表明MCAO模型制備成功；與MCAO組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦組織含水量均明顯降低（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，木犀草素低劑量組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯增加（P＜0.05），而木犀草素高劑量組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分及木犀草素低、高劑量組的腦組織含水量均無明顯變化（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of neurological function injury score,brain tissue water content and cerebral infarct volume after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups表1 各組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦組織含水量及腦梗死體積比較 （n=8，）

Tab.1 Comparison of neurological function injury score,brain tissue water content and cerebral infarct volume after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups表1 各組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦組織含水量及腦梗死體積比較 （n=8，）

＊P＜0.05；a與假手術(shù)組比較，b與MCAO組比較，c與木犀草素低劑量比較，d與木犀草素高劑量組比較，P＜0.05；表2～4同。

組別假手術(shù)組MCAO組木犀草素低劑量組木犀草素高劑量組尼莫地平組F神經(jīng)功能損傷評(píng)分（分）0 2.94±0.36a 2.31±0.25b 2.05±0.30b 1.82±0.22bc 147.046＊腦組織含水量（%）70.76±9.27 86.30±8.39a 75.74±8.11b 74.91±9.35b 71.54±7.71b 4.198＊腦梗死體積（%）0 34.16±4.54a 30.64±3.28b 21.70±2.61b 7.25±1.17bcd 220.315＊

2.2 各組大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積的比較 假手術(shù)組未見腦梗死病灶，MCAO 組腦梗死體積較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.05），進(jìn)一步表明MCAO 模型制備成功；與MCAO 組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組腦梗死體積均明顯降低（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，木犀草素低、高劑量組梗死體積均明顯增加（P＜0.05），見表1、圖1。

Fig.1 TTC staining of cerebral infarction volume of rats in each group圖1 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積

2.3 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織TNF-α、IL-6及IL-1β 含量比較 MCAO 組腦組織 TNF-α、IL-6及IL-1β 含量與假手術(shù)組比較均明顯增加（P＜0.05）；與MCAO組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組的腦組織TNF-α、IL-6 及IL-1β 含量均明顯降低（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，木犀草素低劑量組的腦組織TNF-α、IL-1β含量及木犀草素低、高劑量組的IL-6含量明顯增加（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 and IL-1β contents of brain tissue after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups of rats表2 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織TNF-α、IL-6及IL-1β含量比較 （n=8，ng/L，）

Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 and IL-1β contents of brain tissue after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups of rats表2 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織TNF-α、IL-6及IL-1β含量比較 （n=8，ng/L，）

組別假手術(shù)組MCAO組木犀草素低劑量組木犀草素高劑量組尼莫地平組F TNF-α 41.47±5.70 58.31±7.15a 52.38±5.92b 47.53±4.25b 45.24±6.18bc 9.782＊IL-6 24.83±2.02 37.23±4.86a 31.30±3.31b 30.91±4.67b 25.17±2.46bcd 15.754＊IL-1β 3.25±0.47 6.88±0.83a 5.07±0.68b 4.32±0.51b 4.16±0.56bc 38.145＊

2.4 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織Bcl-2、Bax及Caspase-3含量比較 與假手術(shù)組比較，MCAO 組的腦組織Bcl-2 含量明顯降低，而Bax 及Caspase-3 含量明顯增加（P＜0.05）；與MCAO 組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組的腦組織Bcl-2 含量明顯增加，而Bax 及Caspase-3 含量明顯降低（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，木犀草素低、高劑量組的腦組織Bcl-2 含量明顯降低，木犀草素低劑量組Caspase-3含量明顯增加（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Bax and Caspase-3 contents of brain tissue after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups of rats表3 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織Bcl-2、Bax及Caspase-3含量比較 （n=8，ng/L，）

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Bax and Caspase-3 contents of brain tissue after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups of rats表3 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織Bcl-2、Bax及Caspase-3含量比較 （n=8，ng/L，）

組別假手術(shù)組MCAO組木犀草素低劑量組木犀草素高劑量組尼莫地平組F Bcl-2 16.25±1.46 10.17±0.95a 12.78±1.23b 13.66±1.50b 15.83±2.27bcd 20.371＊Bax 1.47±0.12 1.92±0.26a 1.76±0.11b 1.71±0.28b 1.65±0.20b 5.060＊Caspase-3 19.10±2.45 28.72±3.71a 24.32±2.04b 22.44±3.13b 21.56±1.82bc 13.998＊

2.5 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織JAK2 及STAT3 蛋白磷酸化水平比較 MCAO 組的腦組織JAK2 及STAT3 蛋白磷酸化水平較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.05）；與MCAO組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組的腦組織JAK2 及STAT3 蛋白磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，木犀草素低、高劑量組的腦組織JAK2及STAT3蛋白磷酸化水平明顯增加（P＜0.05），見圖2、表4。

Fig.2 The protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)

Tab.4 Comparison of p-JAK2 and p-STAT3 protein expressions of brain tissue after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups of rats表4 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)量比較 （n=8，）

Tab.4 Comparison of p-JAK2 and p-STAT3 protein expressions of brain tissue after cerebral ischemia and reperfusion between the five groups of rats表4 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)量比較 （n=8，）

組別假手術(shù)組MCAO組木犀草素低劑量組木犀草素高劑量組尼莫地平組F p-JAK2/JAK2 0.12±0.02 1.27±0.14a 1.02±0.13b 0.95±0.10b 0.38±0.05bcd 185.647＊p-STAT3/STAT3 0.08±0.01 0.75±0.08a 0.52±0.06b 0.41±0.06b 0.26±0.03bcd 177.342＊

3 討論

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管疾病治療后的嚴(yán)重并發(fā)癥，主要以運(yùn)動(dòng)和肢體感覺功能障礙為主要特征［10］。MCAO 動(dòng)物模型具有重現(xiàn)性好、無需開顱手術(shù)、顱內(nèi)感染概率低等優(yōu)勢(shì)，在腦缺血再灌注損傷的研究中使用頻率較高［11］。本研究采用線栓法建立MCAO 大鼠模型后發(fā)現(xiàn)，MCAO 組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦組織含水量及腦梗死體積均明顯增加，表明模型制備成功。尼莫地平為二氫吡啶類鈣通道拮抗劑，可降低腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦組織含水量，也可降低腦梗死體積；同時(shí)，尼莫地平也具有較好的抗炎及抗凋亡作用，因此本研究將其作為陽性對(duì)照藥物使用［12-13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦組織含水量及梗死體積均明顯降低，表明木犀草素具有減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的作用。

腦組織缺血再灌注后，釋放炎癥信號(hào)，聚集大量炎性細(xì)胞，導(dǎo)致TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子釋放，最終發(fā)生系列炎癥反應(yīng)。TNF-α 作為炎癥反應(yīng)的起始因子，可促進(jìn)IL-6 及IL-1β 等因子的表達(dá)量增加，引起炎性損傷的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，使腦缺血再灌注損傷加重［14］。IL-6 在腦組織中可誘導(dǎo)磷脂酶-2 基因表達(dá)，刺激炎性因子IL-1β 的產(chǎn)生，加快炎癥進(jìn)展［15］。IL-1β是腦及神經(jīng)組織中IL-1的主要存在形式，可以促進(jìn)白細(xì)胞聚集黏附，并向缺血區(qū)轉(zhuǎn)移及浸潤［16］。本研究結(jié)果顯示，與MCAO組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組大鼠腦組織TNF-α、IL-6及IL-1β 含量均明顯降低，表明木犀草素具有抑制炎癥反應(yīng)，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷作用。

在發(fā)生腦缺血時(shí)，缺血中樞區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡以凋亡為主，因此神經(jīng)元凋亡也是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制［17］。神經(jīng)細(xì)胞凋亡由多重調(diào)節(jié)基因共同參與完成，涉及一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中以Bcl-2、Bax 及Caspase-3 為代表的凋亡因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bcl-2 是研究較為透徹的抗凋亡基因，具有抑制缺血所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用［18］。Bax 可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，Caspase-3 是Caspase 家族中關(guān)鍵的蛋白酶，在缺血引起的早期神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色［19］。已有研究證實(shí)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax、Caspase-3表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡，可以有效保護(hù)腦缺血再灌注引起的損傷［20］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與MCAO組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組大鼠腦組織Bcl-2 含量明顯增加，而 Bax 及 Caspase-3 含量明顯降低，表明木犀草素可以通過減少神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而延緩腦組織損傷。

JAK2/STAT3 信號(hào)通路與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，其中JAK2蛋白主要表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元內(nèi)，而STAT3 蛋白廣泛分布于整個(gè)腦組織中［21］。腦缺血后，JAK2 及STAT3 蛋白磷酸化水平增加，使JAK2/STAT3信號(hào)通路活化，進(jìn)而介導(dǎo)缺血后的炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)大鼠缺血后造成的腦損傷具有緩解作用，其分子機(jī)制與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)［22］。黃角顆?？梢酝ㄟ^降低JAK2及STAT3蛋白磷酸化水平，減少腦組織神經(jīng)元凋亡，在一定程度上延緩大鼠腦缺血再灌注引起的病理改變［23］。本研究結(jié)果同樣證實(shí)，與MCAO 組比較，木犀草素低、高劑量組及尼莫地平組大鼠腦組織JAK2 及STAT3 蛋白磷酸化水平明顯降低，表明抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化是木犀草素減弱炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

綜上，本研究結(jié)果證實(shí)，木犀草素具有減輕大鼠腦缺血再灌注損傷作用，該作用與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路活化，進(jìn)而減弱炎癥反應(yīng)及減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。