Nrf2調控AIM2炎癥小體在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用

侯萬梅，官勁帆，劉炳園，林冬融，趙遠瑜，張娟梓，韓江全

缺血性腦卒中是嚴重威脅人類健康的常見疾病，但目前治療手段有限，深入研究腦缺血損傷的機制，尋找其治療靶點及調控機制具有重要意義。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中疾病進展的關鍵環節，而炎癥反應是缺血再灌注損傷的重要病理生理機制［1］。研究發現，腦缺血再灌注損傷可誘導黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體活化，促進炎性因子的成熟和釋放，放大炎癥反應，加重腦損傷［2］；而AIM2基因敲除或抑制AIM2炎癥小體活化可顯著改善腦缺血再灌注損傷［3］。核因子E2 相關因子2（Nrf2）作為調控內源性抗氧化應激損傷的轉錄因子，可通過抗炎、抗氧化應激、調節細胞凋亡等多個途徑在腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用［4］。Nrf2與AIM2及NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）等炎癥小體之間存在交互作用［5］。但Nrf2 是否通過調控AIM2 炎癥小體而發揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用目前仍不清楚。本研究旨在探討Nrf2 對腦缺血再灌注損傷的影響及AIM2 炎癥小體的調控作用，以期為缺血性腦卒中的防治提供作用靶點及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級健康成年雄性SD大鼠108只，8～10周齡，體質量250～280 g，購自珠海百試通生物科技有限公司［動物許可證編號為SCXK（粵）：20200051］。所有大鼠飼養在溫度為（22±1）℃、濕度為（55±5）%，12 h 光照/12 h 黑暗的籠內，予自由飲水和進食，適應性喂養7 d。按隨機數字表法將大鼠分為：假手術組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（I/R 組）、Nrf2 抑制劑鴉膽子苦醇（Brusatol，Bru）干預組（Bru組），每組再按隨機數字表法根據腦缺血再灌注后不同時間點進一步分為8、24、72 h組，共9組，每組12只。本研究經遵義醫科大學第五附屬（珠海）醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器 Brusatol（美國Sigma公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美國MPBIO 公司）；兔抗大鼠AIM2、Nrf2 多克隆抗體（英國Abcam 公司）；白細胞介素（IL）-1β、IL-18、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（中國Boster公司）；TRIZOL（中國天根生物公司）；蘇木素染液及伊紅染液（北京索萊寶公司）；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）及十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司）；BIO-RAD電泳儀/電泳槽（美國伯樂生命醫學產品有限公司）；Mx3000P 熒光定量PCR（qPCR）儀（美國安捷倫有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立 Bru組大鼠于建模前30 min經側腦室注入Brusato（l1 mg/kg，溶于5μL 1%二甲基亞砜），Sham 組和I/R組于相應時間予側腦室注入等量的溶劑。I/R 組和Bru 組大鼠采用文獻［6］提出的線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）的局灶性腦缺血再灌注損傷模型。造模前先予大鼠禁食、不禁水12 h，用5%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，取仰臥位固定，剃除頸部毛發并用碘伏消毒。于頸部正中行長1.5～2.0 cm 的縱行切口，分離并顯露左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，沿頸總動脈、頸內動脈插入1條特制的硅涂層栓線［線直徑0.28 mm，頭徑（0.38±0.02）mm］，插入18～20 mm 微遇阻力時停止。記錄大鼠腦缺血開始的時間（栓線成功插入時），并縫合頸部皮膚。在腦缺血后90 min，予拆除縫線，緩慢拔出線栓，造成再灌注損傷。Sham組除不插入線栓外，其余操作均同上。造模期間將造模環境溫度維持在25～30 ℃，并使用直腸探頭監測體溫，在整個手術過程中將體溫保持在（37.0±0.5）℃。

1.3.2 神經功能缺損評分 各組大鼠分別于腦缺血再灌注后8、24、72 h 進行神經功能缺損評分。評分標準參照Bederson 評分法［7］：0 分，無神經功能缺損癥狀；1 分，手術對側前肢呈內收屈曲位，不能完全伸展；2分，向手術對側推時抵抗力下降；3分，術后行走時向手術對側轉圈；4分，術后行走時向手術對側傾倒；5 分，無自發性活動，對刺激無反應。評分1～4 分為模型建立成功，納入實驗范疇，造模不成功或未到時間點已死亡者，按照隨機原則補充實驗大鼠，重新建立腦缺血再灌注損傷模型。

1.3.3 TTC染色測定腦梗死面積 腦缺血再灌注后8、24、72 h分別從相應時間點組大鼠中采用簡單隨機抽樣法抽取6只大鼠，用5%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，立即處死并迅速取出腦組織，將腦組織以冠狀位切面橫切成5個厚度相當的切片，置于2% TTC 溶液中37 ℃孵育30 min，染色后用4%甲醛固定24 h，腦切片固定好后進行拍照。切片中紅色區域為正常腦組織區域，白色區域為梗死區域，大腦切片圖像用Image J 軟件進行數字化處理并計算腦梗死面積百分比。腦梗死面積百分比=（對側半腦組織面積-梗死側正常面積）/對側半腦組織面積×100%。

1.3.4 HE染色 將大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃放置固定48 h，24 h更換1次多聚甲醛溶液。固定完成后取出，常規取材、脫水、包埋、切片（厚度3.0μm）。將病理切片置于65 ℃的烘箱中烘烤2 h，用TO透明劑及梯度乙醇進行脫蠟處理，再進行HE 染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察組織形態及病理改變。

1.3.5 qPCR檢測腦組織中AIM2 mRNA的表達 用Trizol法提取缺血側大腦組織的總RNA，經逆轉錄獲取cDNA，以GAPDH 為內參，檢測大鼠腦組織中AIM2 mRNA 的表達水平。引物設計如下：AIM2 上游5'-CACCCTCATGGACCTGTATCAT-3'，下游 5'-GAATCCAAGCCCTCTGCTCT-3'；GAPDH 上游 5'-TACTGTTGTCCAGCTACGGC-3'，下游 5'-CGTCCAAATCCATTGATGCCC-3'。反應條件：95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，60 ℃延伸 30 s，共 40 個循環。實驗獲得的定量基因表達數據，采用2-ΔΔCt法計算AIM2 mRMA的表達情況。

1.3.6 Western blot 檢測 Nrf2 及 AIM2 蛋白表達 稱取 50 mg缺血側腦組織放入勻漿器內，加入1 mL 裂解液（RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1），在冰上迅速研磨，靜置30 min后離心（12 000 r/min，4 ℃，20 min），靜置后收集上清液，提取總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。將總蛋白加入等體積5×蛋白上樣緩沖液后在沸水中煮15 min 使其變性，經SDS-PAGE，通過濕轉法進行轉膜，脫脂奶粉封閉，室溫孵育1 h，加入相應的一抗，即兔抗大鼠AIM2（1∶1 000），兔抗大鼠Nrf2（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，應用TBST洗膜3次，每次10 min，采用山羊抗兔二抗（1∶5 000）繼續孵育2 h，應用TBST 洗膜3 次，每次10 min，化學發光劑顯影曝光，通過Image J軟件對光密度值進行分析。

1.3.7 ELISA 檢測ASC、Caspase-1、IL-1β 及 IL-18 蛋白的表達 采集缺血側大腦半球腦組織，將腦組織勻漿離心后，分離收集上清液。采用相應的ELISA 試劑盒檢測大鼠缺血側腦組織中ASC、Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行數據分析。計量資料進行正態性及方差齊性檢驗，符合正態分布或近似正態分布的均以均數±標準差（）表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齊，組間多重比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，組間多重比較采用Tamhane's T2 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分比較 I/R 組及Bru 組各時間點大鼠神經功能缺損評分較Sham 組升高；與I/R組相比，Bru組相應時間點的神經功能缺損評分均明顯增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of neurological deficit scores between the three groups表1 3組大鼠神經功能缺損評分比較（n=12，分，）

Tab.1 Comparison of neurological deficit scores between the three groups表1 3組大鼠神經功能缺損評分比較（n=12，分，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與I/R組比較，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Bru組F 8 h 0.00±0.00 1.50±0.52a 2.08±0.52ab 77.310＊＊24 h 0.00±0.00 2.50±0.67a 3.17±0.58ab 127.346＊＊72 h 0.00±0.00 2.33±0.65a 3.08±0.67ab 106.843＊＊

2.2 腦梗死面積百分比比較 Sham 組3 個時間點的大鼠腦組織切片均無白色梗死灶；I/R 組及Bru 組大鼠的腦組織在8、24、72 h 均呈現出不同范圍的白色梗死區域；與I/R 組比較，Bru 組大鼠的腦梗死面積百分比更大（P＜0.05），見表2、圖1。

2.3 各組大鼠腦皮質病理形態學變化 HE染色結果顯示，Sham 組大鼠神經細胞形態結構正常，核仁清晰，呈淡藍色，細胞為圓形或橢圓形，排列密集。I/R 組大鼠神經細胞排列紊亂，核仁深染，胞質與胞核之間界限不清、凝結在一起，且大量細胞與細胞外基質之間出現空泡。與I/R 組8 h 相比，24 h 和72 h病理損害更重，I/R 組24 h 和72 h 之間無明顯差異。與I/R 組相比，Bru 組大鼠各相應時間點的病理損害明顯更重，見圖2。

Tab.2 Comparison of the percentage of cerebral infarction area in each group at different time points表2 各組大鼠不同時間點腦梗死面積百分比比較（n=6，%，）

Tab.2 Comparison of the percentage of cerebral infarction area in each group at different time points表2 各組大鼠不同時間點腦梗死面積百分比比較（n=6，%，）

＊P＜0.05。

組別I/R組Bru組t 8 h 6.54±5.08 14.74±6.43 2.451＊24 h 32.41±4.40 48.89±1.46 8.696＊72 h 25.70±3.27 43.82±4.48 8.011＊

2.4 缺血側腦組織中AIM2 mRNA 表達情況 與Sham 組相比，I/R 組及 Bru 組各時間點 AIM2 mRNA水平均明顯升高（P＜0.05）；與I/R 組相比，Bru 組各相應時間點 AIM2 mRNA 水平更高（P＜0.05），見表3。

2.5 Nrf2、AIM2蛋白的表達水平 與Sham組相比，I/R 組及Bru 組各時間點Nrf2 及AIM2 表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與I/R 組相比，Bru 組大鼠各時間點Nrf2蛋白表達水平均降低，AIM2蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。見圖3、4，表4。

Fig.1 Results of TTC stainning圖1 TTC染色結果

Fig.2 Morphological manifestations of the cortical area of the ischemic side of brain tissue in each group of rats (HE staining,×400)圖2 各組大鼠缺血側腦組織皮質區形態學表現（HE染色，×400）

Tab.3 The relative expression level of AIM2 mRNA in brain tissues of each group at different time points表3 各組大鼠腦組織不同時間點AIM2 mRNA表達水平（n=6，）

Tab.3 The relative expression level of AIM2 mRNA in brain tissues of each group at different time points表3 各組大鼠腦組織不同時間點AIM2 mRNA表達水平（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與I/R組比較，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Bru組F 1.00±0.00 1.77±0.12a 2.44±0.09ab 397.986＊＊1.06±0.045 7.22±0.47a 11.59±0.69ab 722.555＊＊1.06±0.038 3.98±0.53a 7.26±0.86ab 168.866＊＊8 h 24 h 72 h

Fig.3 Relative protein expression of Nrf2 in rat brain tissue of each group圖3 各組大鼠腦組織Nrf2蛋白相對表達水平

Fig.4 Relative protein expression of AIM2 in rat brain tissue of each group圖4 各組大鼠腦組織AIM2蛋白相對表達水平

Tab.4 Comparison of Nrf2 and AIM2 protein relative expression levels at different time points in brain tissues of rats in each group表4 各組大鼠腦組織不同時間點Nrf2和AIM2蛋白相對表達水平比較 （n=6，）

Tab.4 Comparison of Nrf2 and AIM2 protein relative expression levels at different time points in brain tissues of rats in each group表4 各組大鼠腦組織不同時間點Nrf2和AIM2蛋白相對表達水平比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與I/R組比較，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Bru組F Nrf2蛋白8 h 0.32±0.02 0.61±0.02a 0.49±0.03ab 190.541＊＊24 h 0.37±0.02 1.28±0.07a 1.11±0.05ab 518.017＊＊72 h 0.40±0.05 1.07±0.06a 0.85±0.10ab 131.230＊＊組別Sham組I/R組Bru組F AIM2蛋白8 h 0.36±0.03 0.56±0.07a 0.70±0.05ab 68.632＊＊24 h 0.39±0.02 1.00±0.05a 1.18±0.03ab 892.462＊＊72 h 0.37±0.03 0.85±0.06a 1.06±0.03ab 429.034＊＊

2.6 腦組織中Caspase-1及炎癥因子IL-1β、IL-18表達 Sham組、I/R組和Bru組ASC、Caspase-1、IL-1β及IL-18的蛋白表達水平依次升高（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of protein expression levels of ASC,Caspase-1,IL-1β and IL-18 in brain tissues of each group at different time points表5 各組大鼠腦組織不同時間點ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平比較（n=12，ng/L，）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of ASC,Caspase-1,IL-1β and IL-18 in brain tissues of each group at different time points表5 各組大鼠腦組織不同時間點ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達水平比較（n=12，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與I/R組比較，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Bru組F ASC蛋白8 h 134.37±9.89 215.08±9.08a 260.29±7.53ab 309.141＊＊24 h 136.54±9.72 400.75±6.60a 461.22±5.78ab 3 131.750＊＊72 h 133.92±10.73 293.01±7.64a 340.15±7.13ab 936.989＊＊組別Sham組I/R組Bru組F Caspase-1蛋白8 h 16.16±1.09 37.78±1.63a 57.00±1.80ab 1 062.102＊＊24 h 16.22±1.05 72.76±2.96a 99.49±3.63ab 1 412.733＊＊72 h 15.95±1.05 48.47±2.84a 68.42±1.78ab 1 026.072＊＊組別Sham組I/R組Bru組F IL-18蛋白8 h 34.13±2.68 69.10±4.80a 98.38±3.29ab 454.373＊＊24 h 37.28±2.11 145.71±12.39a 174.39±8.33ab 414.446＊＊72 h 36.75±3.29 114.73±4.90a 135.02±6.33ab 647.534＊＊組別Sham組I/R組Bru組F IL-1β蛋白8 h 23.11±2.35 30.30±2.22a 40.23±2.83ab 71.973＊＊24 h 21.96±0.78 76.02±4.39a 97.45±4.60ab 664.147＊＊72 h 21.91±1.22 48.30±1.59a 69.92±2.25ab 1 145.327＊＊

3 討論

缺血性腦卒中是由于腦局部血流中斷，腦組織的供氧和葡萄糖的供應發生障礙，從而導致局灶性腦組織缺血壞死或軟化及相應的神經功能缺損表現。其發病率高、致殘率高、復發率高、死亡率高，且近年來發病人群趨于年輕化［8］。目前，對于缺血性腦卒中的治療，公認有效的是在急性治療時間窗內進行溶栓治療。然而，溶栓治療后血管再通的同時會發生缺血再灌注損傷，進一步加重腦損傷。腦缺血再灌注后，腦組織細胞會發生一系列復雜的損傷級聯反應，包括線粒體能量代謝障礙、氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、血腦屏障破壞等［9-11］。其中，炎癥反應被認為是腦缺血再灌注損傷的重要病理機制之一［12］。因此，深入研究新的神經炎癥機制、探尋新的重要的治療靶點及其調控機制十分必要。

Nrf2屬于轉錄因子亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族成員。在正常生理條件下，Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）相結合，在泛素蛋白酶體系下迅速降解，從而維持Nrf2 的穩定以及低水平表達［13］。當氧化應激損傷或有外來刺激時，Nrf2 與Keap1 迅速解離，轉位至細胞核內與抗氧化反應元件（ARE）上的特異位點結合，誘導抗氧化劑和解毒酶及下游相關蛋白的表達，從而發揮其效應［14］。Nrf2在維持大腦的正常生理過程中非常重要。小鼠Nrf2 基因敲除會導致蛋白酶體功能障礙，神經元凋亡，與年齡有關的前腦萎縮和神經行為缺陷，以及腦中多巴胺和5-羥色胺代謝產物水平升高［4］。近年有學者及筆者的前期研究表明，Nrf2 參與了腦缺血再灌注損傷過程，且具有內源性神經保護作用［15-17］。腦缺血再灌注后Nrf2 的表達明顯上調，且梗死周圍區Nrf2 表達水平明顯較中心壞死區更多［18］，推測與梗死周圍區的氧化應激程度更重有關［19］。與野生型小鼠相比，Nrf2 基因敲除小鼠進行短暫性大腦中動脈栓塞造模后，其抗氧化酶和解毒酶的基礎活性和誘導活性均降低，腦梗死面積更大，行為學表現也更差［20］。本研究結果顯示，Nrf2受抑制后，腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能缺損癥狀和腦組織病理損傷程度均明顯加重，腦梗死面積也顯著增加，進一步證實Nrf2在腦缺血再灌注損傷中有確切的內源性神經保護作用。本研究還發現，Nrf2 受抑制可顯著上調促炎細胞因子IL-1β和IL-18的表達水平，加重缺血側腦組織病理損傷，表明抗炎效應是Nrf2 發揮內源性神經保護作用的重要機制之一。

炎癥小體是固有免疫系統最重要的組成部分之一，在各種炎癥相關神經系統疾病的發病機制中起重要作用［21］。AIM2 炎癥小體由 AIM2、Caspase-1 和一種稱為ASC 的銜接蛋白構成。當模式識別受體AIM2 感知到損傷相關分子模式時，就會募集ASC，而ASC 則會募集Caspase-1，導致AIM2 炎癥小體的激活。研究證實，AIM2炎癥小體介導腦缺血再灌注后的腦損傷［2，22］。腦缺血再灌注后，AIM2 炎癥小體活化，使無活性的pro-Caspase-1 轉化為有活性的Caspase-1。Caspase-1 可剪切 pro-IL-1β 和 pro-IL-18，形成有活性的IL-1β 和IL-18，進而招募其他炎性細胞，放大炎癥反應，加重缺血性腦損傷［23］。AIM2炎癥小體可以在缺血損傷大腦的神經元、小膠質細胞及血管內皮細胞中檢測到［24-25］。腦缺血再灌注后大鼠腦內AIM2 炎癥小體信號轉導關鍵成分AIM2、ASC、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的表達水平顯著升高［3］。研究表明，組蛋白脫乙酰化酶3（HDAC3）的選擇性抑制劑可通過抑制小膠質細胞中AIM2炎癥小體的激活來減輕炎癥反應，保護缺血性腦損傷［3］。此外，有研究發現AIM2 基因敲除后，腦缺血再灌注損傷小鼠的缺血側腦組織中的AIM2及IL-1β 蛋白表達出現下調，腦梗死面積及神經功能缺損癥狀顯著改善［4］。本研究結果顯示，Nrf2 受抑制后，缺血側腦組織中的AIM2炎癥小體關鍵組分AIM2、ASC、caspase-1及促炎細胞因子IL-1β和IL-18的表達水平顯著上調，腦組織病理損傷明顯加重，表明AIM2 炎癥小體及炎性介質均參與了腦缺血再灌注損傷過程，對腦缺血再灌注損傷有著重要的影響。

越來越多的證據表明，Nrf2 與炎癥小體之間存在著交互作用。許多與炎癥相關的不同疾病模型中，Nrf2 激活與NLRP3 炎癥小體受抑制之間均存在相關性，例如，在急性肺損傷［26-27］、腦出血后腦損傷［28］、蛛網膜下腔出血后早期腦損傷［29］以及腦缺血再灌注損傷模型［30-32］中，Nrf2 的激活會抑制NLRP3炎癥小體，從而抑制炎癥反應。然而，Nrf2 對AIM2炎癥小體是否存在調控作用尚不清楚。本研究結果顯示，Nrf2 受抑制后，缺血側腦組織中AIM2 炎癥小體關鍵組分AIM2、ASC、Caspase-1 及促炎細胞因子IL-1β 和 IL-18 的表達水平顯著上調，表明 Nrf2 對AIM2炎癥小體具有負性調控作用。

綜上，本研究進一步驗證了Nrf2 具有確切的內源性神經保護作用，并證實其保護作用的機制可能與Nrf2負性調控AIM2炎癥小體，進而減少促炎細胞因子的釋放，減輕神經炎癥反應有關。本研究為臨床治療缺血性腦卒中提供了治療靶點及實驗依據。