三七總皂苷對流產大鼠子宮出血的影響及子宮內膜修復作用機制的研究

張靖，李瀟

目前，米非司酮聯合米索前列醇為終止早孕常用的藥物流產方案，然而，該方案仍可能引起不完全流產［1-2］。子宮內膜是妊娠成功的關鍵因素，易受感染、藥物及各種宮腔操作的影響。異常子宮出血（abnormal uterine bleeding，AUB）是不完全流產常見的嚴重不良反應，如不盡早治療極易引發貧血，造成子宮內膜纖維化、宮腔粘連，進而導致反復流產、月經異常出血和其他婦科并發癥［3-4］。因此，預防和治療不完全流產引起的AUB 具有重要意義。三七是一味傳統中藥，具有活血化瘀、鎮定止痛的功效，又有止血功效。《本草綱目》記載三七可治“崩中經水不止，產后惡血不下”。有研究顯示，三七對AUB有較好的療效［5-6］，但其發揮作用的具體成分及機制尚不明確。三七總皂苷是從三七根中提取的重要化合物，長期以來被用作止血藥［7-8］。有關三七總皂苷對AUB保護作用的相關研究鮮見。本研究旨在探討三七總皂苷對流產大鼠子宮出血的影響及潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠70只，7～8周齡，平均體質量（240±20）g；雄性 SD 大鼠 30 只，7～8 周齡，平均體質量（280±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證為SCXK（京）2019-0009。大鼠飼養于溫度（20±2）℃、濕度45%～55%、12 h光照/12 h黑暗周期條件下，自由飲水和攝食。實驗經本院倫理委員會批準，并按實驗動物使用3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器 三七總皂苷（純度≥98%，成都普菲德生物技術有限公司，批號JOT-11108）；米索前列醇（華潤紫竹藥業有限公司，批號43171106，規格0.2 mg×3片/盒）；米非司酮（湖北葛店人福藥業有限責任公司，批號180102，規格25 mg×60片/盒）；斷血流片（回音必集團安徽制藥有限公司，批號14000433810，規格0.42 g×60 片/盒）；大鼠血漿雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6、6-酮前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；兔抗大鼠CD31抗體、羊抗兔IgG 二抗均購自英國abcam 公司；實時熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）引物由上海GenePharma 公司設計合成。NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo Scientific）；ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）；iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置（美國Bio-Rad 公司）；BZ-X800E一體化熒光顯微成像系統（日本Keyence公司）。

1.3 模型制備及分組 按隨機數字表法抽取10只雌性大鼠為空白對照組，將其余處于動情周期的雌性和雄性大鼠按照雌∶雄=2∶1的比例進行合籠交配，成功交配后，次日清晨對雌性大鼠進行陰道涂片，并置于顯微鏡下觀察，若鏡下（×400）可見陰栓或游動精子，則為受孕成功大鼠，記為妊娠第1天，參考文獻［9］采用米非司酮（8.3 mg/kg）和米索前列醇（100μg/kg）誘導建立AUB 模型。將50 只模型制作成功大鼠隨機分為模型組、陽性組（斷血流片，0.45 g/kg）以及三七總皂苷低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組［10］，每組10只。陽性組給予斷血流片0.45 g/kg灌胃，三七總皂苷各劑量組給予相應劑量的三七總皂苷灌胃，空白對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，共7 d。

1.4 子宮出血量測定 除空白對照組外，其余各組大鼠在給藥的同時將1 個稱取質量后的棉球（85～100 mg）放入陰道。分別于8：00和18：00將棉球取出，放入密閉EP管中于4 ℃保存，取出舊棉球的同時將新棉球放入陰道內，以上操作連續7 d 至給藥結束。給藥結束后，采集大鼠眼眶靜脈血20μL，用4 mL 5%NaOH 溶解。將收集的每只大鼠的棉球置于EP管內，加5 mL 5%NaOH浸漬提取24 h，并充分擠壓棉球血漬至血液完全浸出，過濾后在546 nm波長處測定浸提液以及大鼠靜脈血溶解液的吸光度（A）值，子宮出血量（μL）=［靜脈血量（μL）×A棉球血浸提液×浸泡棉球血所用 NaOH 體積（mL）］/［A靜脈血×溶解靜脈血所用NaOH體積（mL）］。

1.5 ELISA 檢測血漿炎性因子、E2、P、TXB2 以及 6-keto-PGF1α 水平 給藥結束后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經腹主動脈取血2 mL，靜置后1 500 r/min離心10 min，分離血漿，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血漿TNF-α、IL-6、E2、P、TXB2、6-keto-PGF1α水平。

1.6 子宮內膜病理損傷觀察 取大鼠子宮，分為2 部分，一部分-80 ℃冰箱保存；另一部分置于4%多聚甲醛中固定過夜，包埋在石蠟中,切4 μm 厚切片，分別進行HE 染色和Masson 染色觀察子宮內膜的病理損傷和膠原蛋白的積累。每張切片均隨機讀取4個高倍鏡視野，計數子宮內膜腺體數量，并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量子宮內膜的厚度和子宮內膜的纖維化面積比。子宮內膜厚度為子宮漿膜層和子宮腔表面之間的垂直距離。纖維化面積比=子宮內膜間質的纖維化面積/子宮內膜的間質以及腺體總面積（不包括子宮腔）×100%。

1.7 免疫熒光染色法檢測子宮內膜組織中微血管密度（MVD） 取1.6 制備的子宮組織石蠟塊，切取子宮內膜組織5μm，微波修復后用10%正常山羊血清封閉1 h，加入一抗兔抗大鼠CD31 抗體（1∶100），4 ℃過夜，洗去一抗，滴加二抗羊抗兔lgG-FITC（1∶200），室溫孵育1 h，DAPI 復染細胞核，甘油封片，于熒光顯微鏡下（×400）取3個視野，計算微血管數，取平均值作為該組織切片的MVD。子宮內膜組織中CD31標記的內皮細胞呈紅色熒光，DAPI重染細胞核呈藍色熒光，合并圖像中的亮色是微血管。

1.8 qPCR檢測子宮組織血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9mRNA的表達 取-80 ℃冰箱保存的子宮組織，剪碎后使用Trizol 試劑提取總RNA。分光光度計測量總RNA 濃度。使用PrimeScriptTMRT 試劑盒將RNA 反轉錄為互補DNA（cDNA），進行qPCR。反應體系（20 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性18 s，60 ℃持續55 s，最后72 ℃延伸2 min，40個循環。所有反應均重復3 次。mRNA 的表達量采用2-ΔΔCt方法計算，β-actin作為內參，引物序列見表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠子宮出血量和TXB2、6-keto-PGF1α水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血漿TXB2 水 平 降 低 ，6-keto-PGF1α 水 平 增 加（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和三七總皂苷高劑量組大鼠子宮出血量、6-keto-PGF1α 水平降低，TXB2水平增加（P＜0.05）；與陽性組比較，三七總皂苷高劑量組大鼠上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），而三七總皂苷低劑量組子宮出血量、6-keto-PGF1α水平均增加，TXB2水平降低（P＜0.05），三七總皂苷中劑量組子宮出血量增加，TXB2 水平降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of uterine bleeding and coagulation function of rats between the six groups表2 各組大鼠子宮出血量及凝血功能比較（n=10，）

Tab.2 Comparison of uterine bleeding and coagulation function of rats between the six groups表2 各組大鼠子宮出血量及凝血功能比較（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與模型組比較，c與陽性組比較，d與三七總皂苷低劑量組比較，e與三七總皂苷中劑量組比較，P＜0.05。

組別空白對照組模型組陽性組三七總皂苷低劑量組三七總皂苷中劑量組三七總皂苷高劑量組F子宮出血量（μL）-411.06±45.67 215.84±30.53b 394.52±40.46c 308.64±31.12bcd 220.37±27.80bde 214.603＊＊TXB2（ng/L）503.92±54.08 341.45±42.17a 456.28±49.32b 358.11±40.83ac 390.79±42.61acd 447.66±46.59bd 18.671＊＊6-keto-PGF1α（ng/L）456.47±52.33 593.86±64.29a 480.75±56.32b 583.70±60.01ac 540.24±59.03ad 485.68±55.14bd 9.863＊＊

2.2 各組大鼠血漿炎性因子和雌激素水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血漿TNF-α、IL-6 水平增加，E2、P 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和三七總皂苷中、高劑量組大鼠血漿TNF-α、IL-6水平降低，E2水平升高（P＜0.05）；與陽性組比較，三七總皂苷高劑量組大鼠上述指標差異無統計學意義（P＞0.05），而三七總皂苷中、低劑量組TNF-α、IL-6 水平升高，E2水平降低（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of serum inflammatory factors and estrogen levels of rats between the six groups表3 各組大鼠血清炎性因子和雌激素水平比較 （n=10，μg/L，）

Tab.3 Comparison of serum inflammatory factors and estrogen levels of rats between the six groups表3 各組大鼠血清炎性因子和雌激素水平比較 （n=10，μg/L，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與模型組比較，c與陽性組比較，d與三七總皂苷低劑量組比較，e與三七總皂苷中劑量組比較，P＜0.05。

組別空白對照組模型組陽性組三七總皂苷低劑量組三七總皂苷中劑量組三七總皂苷高劑量組F TNF-α 52.18±7.45 116.29±12.14a 81.04±9.38ab 107.84±11.55ac 95.72±12.35abc 84.51±10.69abd 44.834＊＊IL-6 5.44±0.73 17.30±1.10a 8.56±0.92ab 15.58±1.24ac 12.46±1.13abcd 9.21±1.05abde 187.730＊＊E2P 148.15±16.27 93.64±11.50a 133.27±14.96b 102.13±11.65ac 114.52±12.37abc 130.81±13.82bd 23.210＊＊6.35±0.70 5.21±0.63a 5.87±0.66 5.34±0.57a 5.49±0.62a 5.83±0.69 4.211＊＊

2.3 各組大鼠子宮內膜病理損傷情況比較

2.3.1 HE 染色結果 空白對照組大鼠子宮內膜細胞結構完整，排列整齊；模型組大鼠可見子宮內膜上絨毛和蛻膜殘留較多，內皮細胞充血水腫，子宮內膜缺損。與空白對照組比較，模型組子宮內膜厚度、腺體數量降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和三七總皂苷中、高劑量組大鼠子宮內膜損傷減輕，子宮內膜厚度、腺體數量增加（P＜0.05）；與陽性組比較，三七總皂苷高劑量組大鼠子宮內膜厚度、腺體數量差異無統計學意義（P＞0.05），而三七總皂苷中、低劑量組子宮內膜厚度、腺體數量均降低（P＜0.05），見圖1、表4。

Fig.1 HE and Masson staining of endometrium of rats in each group(×200)圖1 各組大鼠子宮內膜組織HE、Masson染色（×200）

2.3.2 Masson 染色結果 與空白對照組比較，模型組大鼠子宮組織的纖維化面積比增加（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和三七總皂苷中、高劑量組大鼠子宮組織的纖維化面積比減少（P＜0.05）；與陽性組比較，三七總皂苷高劑量組大鼠子宮組織的纖維化面積比差異無統計學意義（P＞0.05），而三七總皂苷中、低劑量組纖維化面積比增加（P＜0.05），見圖1、表4。

Tab.4 Comparison of pathological damage of endometrium and MVD between the six groups表4 各組大鼠子宮內膜病理損傷和MVD比較（n=10，）

Tab.4 Comparison of pathological damage of endometrium and MVD between the six groups表4 各組大鼠子宮內膜病理損傷和MVD比較（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與模型組比較，c與陽性組比較，d與三七總皂苷低劑量組比較，e與三七總皂苷中劑量組比較，P＜0.05；表5同。

組別空白對照組模型組陽性組三七總皂苷低劑量組三七總皂苷中劑量組三七總皂苷高劑量組F子宮內膜厚度（mm）354.82±41.63 186.51±32.94a 312.63±35.17b 201.43±28.69ac 254.78±30.85abcd 307.19±34.34abde 38.175＊＊腺體數量［個/高倍鏡視野（HP）］12.70±1.35 4.35±0.82a 10.10±1.13ab 6.65±0.94ac 7.23±0.85abc 9.75±1.06abde 81.235＊＊組別空白對照組模型組陽性組三七總皂苷低劑量組三七總皂苷中劑量組三七總皂苷高劑量組F纖維化面積比（%）20.45±3.36 53.63±5.54a 32.07±4.20ab 48.96±5.12ac 41.25±4.63abcd 36.11±4.15abd 69.245＊＊MVD（個/HP）27.35±2.81 8.41±1.76a 16.20±1.95ab 9.22±1.34ac 11.37±1.52abc 14.89±1.66abde 134.582＊＊

2.4 各組大鼠子宮內膜MVD 比較 與空白對照組比較，模型組大鼠子宮內膜MVD減少（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和三七總皂苷中、高劑量組大鼠子宮內膜MVD增加（P＜0.05）；與陽性組比較，三七總皂苷高劑量組大鼠子宮內膜MVD 差異無統計學意義（P＞0.05），而三七總皂苷中、低劑量組子宮內膜MVD減少（P＜0.05），見表4、圖2。

2.5 各組大鼠子宮組織VEGF、MMP-2和MMP-9mRNA 表達 與空白對照組比較，模型組大鼠子宮組織MMP-2和MMP-9mRNA 表達水平增加，VEGFmRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和三七總皂苷高劑量組大鼠子宮組織VEGFmRNA 表達增加，MMP-2和MMP-9mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與陽性組比較，三七總皂苷高劑量組大鼠子宮組織上述指標表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），而三七總皂苷低劑量組MMP-2和MMP-9mRNA 表達水平增加，VEGFmRNA 表達降低，三七總皂苷中劑量組VEGFmRNA 表達水平降低（P＜0.05），見表5。

Fig.2 Immunofluorescence staining of CD31 in endometrium of rats in each group(×400)圖2 各組大鼠子宮內膜CD31免疫熒光染色（×400）

Tab.5 Comparison of VEGF,MMP-2 and MMP-9 mRNA expression in uterine tissues of rats between the six groups表5 各組大鼠子宮組織中VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表達比較 （n=10，）

Tab.5 Comparison of VEGF,MMP-2 and MMP-9 mRNA expression in uterine tissues of rats between the six groups表5 各組大鼠子宮組織中VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表達比較 （n=10，）

組別空白對照組模型組陽性組三七總皂苷低劑量組三七總皂苷中劑量組三七總皂苷高劑量組F VEGF 1.00±0.00 0.64±0.07a 1.32±0.13ab 0.72±0.09ac 0.93±0.10bcd 1.25±0.14abde 75.536＊＊MMP-2 1.00±0.00 1.51±0.15a 1.23±0.14ab 1.45±0.12ac 1.39±0.17a 1.27±0.15abd 18.916＊＊MMP-9 1.00±0.00 1.43±0.16a 1.17±0.12ab 1.38±0.14ac 1.31±0.15a 1.20±0.13abd 15.065＊＊

3 討論

AUB 的主要病理特征是有大量出血、子宮內膜損傷、子宮組織炎癥及凝血缺陷。懷孕大鼠在給予米非司酮和米索前列醇灌胃后出現大量月經出血和殘留壞死蛻膜，這與AUB 的癥狀一致。TXB2 和6-keto-PGF1α 是影響凝血功能的常見因素，TXB2 由TXA2 轉化而來，影響血小板聚集和血管收縮；6-keto-PGF1α 通過抑制血小板聚集而發揮抗凝作用［11］。藥物引起的不完全流產后機體激素水平降低可觸發炎癥細胞流入子宮內膜，導致蛻膜和絨毛的降解和壞死。TNF-α 和IL-6 是與炎癥相關的常見細胞因子，TNF-α的過度表達與著床、胎盤和妊娠相關的炎癥機制有關，對妊娠有不利影響，可導致流產；過度表達的IL-6也對妊娠產生負面影響［12］。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組子宮出血量、6-keto-PGF1α、TNF-α、IL-6 水平均增加，而TXB2、E2、P 降低；病理染色可見模型組子宮內膜上絨毛和蛻膜殘留較多，內皮細胞充血水腫，子宮內膜缺損，表明模型大鼠子宮發生炎癥和凝血功能障礙，子宮內膜損傷，AUB模型構建成功。

三七總皂苷是一種含有多種不同皂苷的混合物，具有顯著的抗炎和雌激素樣生物活性。研究顯示，三七總皂苷可降低血清TNF-α、IL-6 以及白細胞和中性粒細胞計數，減輕油酸脂多糖所致的大鼠急性肺損傷［13］；可改善小鼠缺血再灌注后白細胞黏附和腦血管內皮屏障破壞［14］；還可抑制TNF-α誘導的骨關節炎軟骨細胞衰老和凋亡［15］。因此，三七總皂苷可以用作抗炎劑。Fan 等［16］發現，三七總皂苷可預防雌激素缺乏引起的骨質流失。本研究結果顯示，模型大鼠在給予高劑量三七總皂苷干預后，子宮出血量、6-keto-PGF1α 和炎性因子水平降低，TXB2、E2升高，子宮內膜損傷減輕，提示高劑量三七總皂苷可治療流產大鼠子宮出血，其治療作用可能與抑制子宮內膜炎癥、促進雌孕激素水平和凝血功能恢復有關。

合適厚度的子宮內膜能夠為胚胎植入提供優良的場所，是確保妊娠成功的關鍵，但是人工流產極易損傷子宮內膜，使其厚度過薄，內膜腺體及間質出現萎縮，同時纖維組織明顯地增生，內膜逐漸瘢痕化，影響子宮內膜容受性，進而導致胚胎著床失敗。子宮內膜的厚度、腺體數量及纖維化程度是衡量子宮內膜損傷是否得到修復的重要指標。MMP 可通過基底膜破壞子宮內膜間連接，影響子宮內膜的重建和修復。三七總皂苷能降低MMP-9水平，改善心肌梗死大鼠的心功能和纖維化［17］。本研究結果顯示，高劑量的三七總皂苷能增加模型大鼠的子宮內膜厚度和腺體數量，降低纖維化面積比及MMP-2和MMP-9mRNA表達水平，減輕子宮纖維化程度，表明高劑量三七總皂苷可促進子宮內膜損傷后的修復。

組織的再生修復依賴于血管的生成及血流灌注情況，因此血管生成情況也是子宮內膜修復評價指標。MVD是衡量微血管新生的定量指標，即子宮內膜組織中MVD 值越高，新生毛細血管越豐富；且與血管生成密切相關的VEGF被認為是子宮內膜修復的關鍵因素［18］。三七總皂苷也是潛在的血管生成劑，其可通過促進骨質疏松模型小鼠的血管生成來預防骨質流失［19］，并增加VEGF表達，促進內皮祖細胞血管生成［20］。本研究結果顯示，模型大鼠子宮MVD和VEGF較正常大鼠降低，而高劑量的三七總皂苷干預后子宮MVD和VEGFmRNA水平增加，新生血管增多，提示高劑量三七總皂苷可促進血管生成。

綜上所述，高劑量三七總皂苷可治療流產大鼠子宮出血，其作用機制可能是抑制過度纖維化和炎癥，上調VEGF 表達，促進血管重塑，進而促進子宮內膜修復，但其通過何種途徑減輕子宮組織炎癥反應和纖維化程度，仍有待進一步研究。此外，已知三七總皂苷是一種活性化合物的混合物，明確這些化合物中促進子宮血管生成的皂苷，以及這些皂苷是否具有協同作用以驅動血管生成活性，也是今后研究的重點。