黃芩素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的影響及機制研究

王琳，李作孝

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經系統(tǒng)白質受累為主的自身免疫性脫髓鞘疾病，致殘率極高，且發(fā)病機制尚不明確。目前尚無治愈MS的藥物，因此對MS進行深入探究、尋找有效干預藥物至關重要［1］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalitis，EAE）與 MS具有相似的免疫病理改變，是目前公認的研究MS的理想動物模型［2］。小膠質細胞（microglia，MG）是中樞神經系統(tǒng)的固有免疫細胞。有研究發(fā)現，MG激活及其驅動的神經炎癥是MS/EAE 發(fā)病、進展和消退的關鍵因素，調節(jié)MG的M1（經典促炎表型）/M2（替代抗炎表型）亞型的極化成為減輕中樞神經系統(tǒng)炎癥及促進神經再髓鞘化的重要靶點［3-4］。黃芩素（baicalein，BAI）是從唇形科植物黃芩根部提取的一種黃酮類物質，具有減輕炎癥、氧化損傷，保護神經元等功效［5］。既往研究發(fā)現，黃芩素對脂多糖（LPS）誘導的MG 神經炎癥具有保護作用［6］。本實驗建立EAE 小鼠模型，通過觀察BAI 對EAE 小鼠發(fā)病及神經功能變化、脊髓脫髓鞘程度的影響，檢測脊髓組織中M1 型MG 標志物誘導性一氧化氮合酶（iNOS）、M2型MG 標志物精氨酸酶1（Arg1）以及炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）的表達和MG 的形態(tài)變化，探究BAI 對EAE 的防治作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 50 只 6～8 周齡 SPF 級 C57BL/6 雌性小鼠，體質量18～20 g，購自武漢市恒意賽實驗有限公司，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學忠山校區(qū)動物房，室溫保持于23～25 ℃，12 h明暗交替，食料和飲水自由。適應性喂養(yǎng)1周后，應用隨機數字表法將小鼠分為空白對照組，EAE 模型組及BAI 低、中、高劑量組，每組10只。實驗過程通過西南醫(yī)科大學《實驗動物福利倫理》審查，受理編號20210601-5。

1.2 主要試劑與儀器 黃芩素試劑購自上海麥克林生化科技有限公司，小鼠髓鞘少突膠質細胞糖蛋白多肽段（MOG35-55）購自四川國泰生物科技有限公司，滅活結核分枝桿菌購自美國BD公司，百日咳毒素購自美國Sigma 公司，Luxol Fast Blue（LFB）染液試劑 盒購自 Aspen 公司，TRIpure 試 劑、EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒、EnTurbo?SYBR Green PCR SuperMix 試劑盒均購自ELK Biotechnology公司，一抗兔源離子鈣接頭蛋白1（Iba-1）抗體購自Servicebio公司，鼠源iNOS 抗體、鼠源Arg1 抗體均購自Abcam 公司，二抗FITC 標記山羊抗兔抗體、CY3 標記山羊抗小鼠抗體及DAPI 染液均購自Aspen 公司，普通光學顯微鏡購自OLYMPUS 公司，PCR 儀購自杭州博日科技公司，熒光定量PCR儀購自Life technologies公司。

1.3 研究方法

1.3.1 EAE 模型制備及干預 將MOG35-55 溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，質量濃度為5 g/L，然后加入相同體積（1∶1）的完全弗氏佐劑（CFA）和滅活結核分枝桿菌，通過三通管冰浴快速反復推送乳化形成油包水狀態(tài)，最終使乳化劑中結核分枝桿菌質量濃度達4 g/L。EAE模型組、BAI各劑量組小鼠脊柱兩側任意4點皮下注射配置好的乳化劑，每只小鼠劑量為0.2 mL，并分別于造模當日及48 h 后腹腔注射0.2 mg 百日咳毒素稀釋液增強免疫，進行EAE模型制備?？瞻讓φ战M以相同的方式注射等體積生理鹽水。自造模日起，BAI低、中、高各劑量組每日分別給予BAI 75、150、300 mg/kg 灌胃，連續(xù)14 d，其余各組以相同方式給予等體積生理鹽水。

1.3.2 小鼠發(fā)病情況觀察及神經功能障礙評分 采用盲法，自造模日起每日9：00觀察各組小鼠的發(fā)病情況并進行神經功能障礙評分。評分標準采用改良 Kono’s 5 分法［7］：未發(fā)病，0分；尾巴尖端下垂，0.5分；尾巴拖地，1分；單后肢部分癱瘓，1.5 分；單后肢完全癱瘓，2 分；單后肢癱瘓伴另一后肢部分癱瘓，2.5 分；雙后肢完全癱瘓，3 分；雙后肢癱瘓伴一前肢癱瘓，3.5分；四肢癱瘓，4分；死亡，5分。根據評分判斷各組小鼠的發(fā)病潛伏期、高峰期及嚴重程度。EAE的發(fā)病高峰期判定標準為連續(xù)3 d 小鼠神經功能障礙評分未再增加、四肢癱瘓甚至死亡。將各組小鼠在發(fā)病高峰期處死取材，空白對照組和未發(fā)病的小鼠則在飼養(yǎng)28 d后處死取材，將取出的完整脊髓組織，一部分制成石蠟切片，另一部分液氮冷凍備用。

1.3.3 脊髓組織LFB 染色及脫髓鞘評分 將新鮮脊髓組織固定于4%多聚甲醛24 h以上，然后脫水、石蠟包埋、切片（厚度 6 μm），取切片脫蠟、醇化，放入LFB 染液中60 ℃水浴24 h，隨后醇化、分化、風干、封片。顯微鏡下觀察，進行脫髓鞘評分。評分標準［8］：髓鞘完整，0分；點狀髓鞘脫失，1分；局灶性髓鞘脫失，2分；大面積髓鞘脫失，3分。

1.3.4 免疫熒光雙重染色法檢測Iba-1 陽性MG 中iNOS、Arg1的表達情況及MG的形態(tài)變化 取已制備的脊髓石蠟切片置于65 ℃中烘片2 h，脫蠟水化，抗原修復，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，于3%H2O2中避光孵育10 min，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min，每張切片加入稀釋的一抗兔抗Iba-1 抗體（1∶100）、小鼠抗iNOS 抗體（1∶150）、小鼠抗Arg-1抗體（1∶150），4 ℃過夜。次日，PBS洗去一抗，每張切片加CY3標記山羊抗小鼠抗體（1∶50）、FITC標記山羊抗兔抗體（1∶50），37 ℃孵育50 min，經PBS洗滌每張切片加50～100 μL DAPI染液，室溫避光孵育5 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅劑，封片，熒光顯微鏡下觀察。顯微鏡下每張切片隨機讀取3 個非重疊視野進行觀察，用Image Pro plus 6.0 軟件分析視野內蛋白陽性表達區(qū)域的累積吸光度值。同時以分歧指數（index of ramification，RI）［9］判定 MG 向 M1/M2 表型極化的傾向。RI指細胞胞體與細胞遠端分枝連線面積比，RI值越大，胞體越大，分枝越短，MG傾向于向M1表型極化；RI值越小，胞體越小，分枝越長，MG傾向于向M2表型極化。

1.3.5 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測iNOS、Arg1、TNF-α、IL-10 mRNA 表達 取液氮凍存的脊髓組織于TRIpure 試劑中充分研磨提取總RNA，采用EntiLink?1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒逆轉錄合成第一鏈cDNA，然后使用EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix 試劑盒進行PCR 反應。反應體系：2×Master Mix 5μL，上下游引物1μL，cDNA 1μL，雙蒸水2 μL，Rox 染料1 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。以GAPDH 為內參，通過2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平。PCR引物由ELK Biotechnology公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for PCR表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的發(fā)病情況及神經功能障礙評分 空白對照組小鼠未見發(fā)病。EAE模型組及BAI各干預組小鼠均有不同程度發(fā)病，各組小鼠均未死亡。EAE 模型組小鼠自免疫后（8.80±0.92）d 逐漸出現食欲減退、精神不振、體質量下降、毛發(fā)脫落、步態(tài)不穩(wěn)，并伴有不同程度的尾部癱瘓、四肢癱瘓等癥狀。與EAE 模型組比較，BAI 各劑量組發(fā)病潛伏期及達高峰期時間延長，神經功能障礙評分降低，且BAI干預劑量越大，效果越明顯，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of latent period,peak period and peak neurological dysfunction scores between the four groups of mice表2 各組小鼠發(fā)病潛伏期、達高峰期時間、神經功能障礙評分比較 （n=10，）

Tab.2 Comparison of latent period,peak period and peak neurological dysfunction scores between the four groups of mice表2 各組小鼠發(fā)病潛伏期、達高峰期時間、神經功能障礙評分比較 （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與EAE模型組比較，b與BAI低劑量組比較，c與BAI中劑量組比較，P＜0.05。

組別EAE模型組BAI低劑量組BAI中劑量組BAI高劑量組F潛伏期（d）8.80±0.92 9.80±1.03a 11.70±1.06ab 13.30±1.34abc 33.235＊＊達高峰期時間（d）13.60±0.84 14.70±0.95a 16.30±1.06ab 18.90±1.20abc 50.840＊＊神經功能障礙評分（分）3.80±0.54 3.20±0.34a 2.60±0.39ab 1.90±0.39abc 36.549＊＊

2.2 各組小鼠脊髓組織脫髓鞘情況 空白對照組小鼠脊髓組織髓鞘結構清晰完整，未見脫髓鞘。EAE 模型組、BAI 各劑量組小鼠可見程度不等的藍色淺染或白色脫染髓鞘脫失區(qū)域。EAE模型組髓鞘脫失最嚴重，存在大量白色脫染空泡化改變，BAI各劑量組脫髓鞘情況較EAE 明顯減輕，白色脫染空泡化區(qū)域減少。隨著BAI 劑量的增加，脫髓鞘程度和空泡化程度逐漸減輕?？瞻讓φ战M，EAE 模型組，BAI 低、中、高劑量組脫髓鞘評分分別為0、3.00±0.00、2.25±0.50、1.50±0.58、0.75±0.50（單位：分，n=4，F=33.750，P＜0.01），各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Demyelination of spinal cord in each group(LFB staining，×400)圖1 各組小鼠脊髓組織脫髓鞘情況（LFB染色，×400）

2.3 各組小鼠脊髓組織Iba-1 陽性MG 中iNOS、Arg1的表達情況及MG的形態(tài)變化 與空白對照組比較，EAE 模型組Merge 圖中綠染的Iba-1 陽性MG明顯增多，且細胞中紅染的iNOS、Arg1 蛋白的表達明顯增加（P＜0.05）。與EAE模型組比較，BAI各劑量組綠染的Iba-1陽性MG逐漸減少，且其細胞中紅染 iNOS 蛋白表達減少，Arg1 蛋白表達增加；BAI 劑量越大，上述指標變化越明顯。除空白對照組與BAI 高劑量組外，其余各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，與空白對照組比較，EAE模型組Iba-1 陽性MG 多表現為胞突收縮，胞體較大，RI值增加（P＜0.05），形態(tài)傾向于M1型極化。而BAI 各劑量組 Iba-1 陽性 MG 較 EAE 模型組胞突伸展細長，胞體較小，RI 值減小，形態(tài)傾向于M2 型極化；BAI 劑量越大，差異越明顯，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3，圖2、3。

Tab.3 Expression levels of iNOS and Arg1 and RI value of microglia in spinal cord of mice in each group表3 各組小鼠脊髓組織中小膠質細胞iNOS、Arg1的表達情況及RI值 （n=3，）

Tab.3 Expression levels of iNOS and Arg1 and RI value of microglia in spinal cord of mice in each group表3 各組小鼠脊髓組織中小膠質細胞iNOS、Arg1的表達情況及RI值 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與EAE 模型組比較，c與BAI 低劑量組比較，d與BAI中劑量組比較，P＜0.05。

組別空白對照組EAE模型組BAI低劑量組BAI中劑量組BAI高劑量組F iNOS 444.58±71.39 3 068.56±296.97a 1 440.47±150.96ab 1 083.27±160.67abc 634.10±108.23bcd 106.538＊＊Arg1 103.51±19.08 250.46±44.24a 427.07±78.60ab 541.03±52.53abc 730.77±68.26abcd 56.484＊＊RI值0.21±0.03 0.81±0.07a 0.64±0.04ab 0.42±0.05abc 0.31±0.02abcd 95.418＊＊

Fig.2 Expression of iNOS in microglia of spinal cord of mice in each group(immunofluorescent staining，×400)圖2 各組小鼠脊髓組織小膠質細胞中iNOS的表達（免疫熒光染色，×400）

2.4 各組小鼠脊髓組織M1/M2型MG標志物iNOS、Arg1 及炎性因子 TNF-α、IL-10 mRNA 的表達情況 與空白對照組比較，EAE 模型組iNOS、Arg1、TNF-α、IL-10 mRNA 表達升高（P＜0.05）。與EAE模型組比較，BAI 低、中、高劑量組 iNOS 和 TNF-α mRNA 表達降低，Arg1 和 IL-10 mRNA 表達升高，且BAI劑量越大，變化越明顯，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

Fig.3 Expression of Arg1 in microglia of spinal cord of mice in each group(immunofluorescent staining，×400)圖3 各組小鼠脊髓組織小膠質細胞中Arg1的表達（免疫熒光染色，×400）

Tab.4 Expression levels of iNOS,Arg1,TNF-α and IL-10 mRNA of spinal cord of mice in each group表4 各組小鼠脊髓組織中iNOS、Arg1、TNF-α及IL-10的mRNA表達 （n=3，）

Tab.4 Expression levels of iNOS,Arg1,TNF-α and IL-10 mRNA of spinal cord of mice in each group表4 各組小鼠脊髓組織中iNOS、Arg1、TNF-α及IL-10的mRNA表達 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與EAE 模型組比較，c與BAI 低劑量組比較，d與BAI中劑量組比較，P＜0.05。

組別空白對照組EAE模型組BAI低劑量組BAI中劑量組BAI高劑量組F iNOS 0.99±0.14 4.12±0.33a 3.29±0.31ab 2.67±0.19abc 2.11±0.26abcd 64.143＊＊Arg1 0.89±0.12 1.40±0.18a 1.98±0.30ab 2.62±0.25abc 3.36±0.23abcd 55.833＊＊TNF-α 0.93±0.08 3.93±0.27a 3.50±0.21ab 3.02±0.21abc 2.15±0.23abcd 97.958＊＊IL-10 1.06±0.08 1.83±0.23a 2.42±0.16ab 3.17±0.32abc 4.13±0.28abcd 80.687＊＊

3 討論

MS 是一種好發(fā)于中青年的中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘疾病，反復發(fā)作最終造成神經功能不可逆缺損，致殘率極高［10］。在既往對帕金森病、阿爾茨海默病等神經退行性疾病的研究中發(fā)現，BAI 可透過血腦屏障，具有神經保護作用［11］。Yang等［12］發(fā)現，BAI可通過調節(jié)MG M1/M2極化以及細胞自噬和凋亡發(fā)揮抗炎作用，減輕腦缺血再灌注損傷。Xu等［13］研究顯示，BAI能抑制12/15-脂肪氧合酶（12/15-LO）致EAE小鼠MG 中過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）β/δ的表達，從而減輕EAE 小鼠的炎癥反應。本實驗建立EAE模型并予以BAI干預治療研究，結果顯示，與EAE 模型組比較，BAI 各劑量組小鼠發(fā)病潛伏期及達高峰期時間延長，高峰期四肢癱瘓程度減輕，神經功能障礙評分降低，并且發(fā)病高峰期脊髓組織脫髓鞘程度明顯減輕，表明BAI 可改善EAE 小鼠的發(fā)病情況及嚴重程度，對EAE小鼠發(fā)病有防治作用。

MG是中樞神經系統(tǒng)的固有巨噬細胞，具有維持中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。當機體遭受刺激時，MG 被激活，表現出不同的活性狀態(tài)，主要分為“經典活化”M1型和“替代活化”M2型。其中，M1型形態(tài)上胞體較大、胞突回縮，呈阿米巴樣，可通過產生促炎因子（TNF-α、IL-1β）、活性氧物質（ROS）、iNOS 以及一氧化氮（NO）等誘發(fā)炎癥和神經毒性，iNOS 是其特異性標志物；M2 型胞體較小，胞突伸展，呈分枝樣，可促進IL-10、轉化生長因子-β（TGF-β）等抗炎細胞因子的釋放，誘導Arg1 生成，促進精氨酸向多胺的轉化，促進腦源性神經營養(yǎng)因子的分泌，發(fā)揮神經保護和損傷修復作用，Arg-1是其特異性標志物［14-15］。既往在脊髓損傷、缺血性腦卒中及神經退行性疾病（阿爾茨海默病、帕金森病）的研究中發(fā)現，M1 型 MG 具有神經毒性，M2 型 MG 可促進髓鞘再生及減輕炎癥反應［16-18］。Mikita 等［19］在復發(fā)性EAE大鼠模型中發(fā)現，M1/M2小膠質細胞/巨噬細胞失衡是MS/EAE 復發(fā)進展的關鍵因素，使用體外激活的M2 巨噬細胞治療可抑制EAE 的炎癥反應，促進疾病恢復，證明了促進M2型細胞分化是新的藥物治療靶點。因此，調節(jié)MG 向不同表型極化可成為改善CNS 炎癥的重要途徑。本實驗研究發(fā)現，與空白對照組比較，EAE模型組小鼠發(fā)病高峰期Iba-1陽性 MG 明顯增多，其中iNOS、Arg1 表達增加，RI 指數增大，脊髓組織內iNOS、Arg1 mRNA表達升高，提示EAE小鼠發(fā)病高峰期MG被大量活化，激活的MG向M1 型極化為主，存在M1/M2 型MG 的比例失衡。使用BAI干預后發(fā)現，與EAE模型比較，BAI各劑量組發(fā)病高峰期Iba-1 陽性MG 減少，其中iNOS 表達減少、Arg1表達增加、RI指數逐漸減小，脊髓組織內iNOS mRNA 表達降低、Arg1 mRNA 表達升高，說明BAI干預后EAE小鼠中MG的激活減少，并且激活的MG 逐漸向 M2 型極化，M1 型 MG 較前減少，且呈劑量依賴性。以上結果提示BAI 可誘導EAE 小鼠MG向M2型極化，糾正M1/M2型MG失衡。

TNF-α和IL-10是MG分泌的重要細胞因子，在免疫炎癥過程中發(fā)揮重要作用。其中TNF-α 主要通過與腫瘤壞死因子1 型受體（TNFR1）結合，一方面激活核因子-κB（NK-κB），進而轉錄促炎基因，另一方面激活caspase-8和caspase-3，導致細胞凋亡而發(fā)揮作用［20］。IL-10 則可抑制單核細胞和巨噬細胞向T 細胞呈遞抗原的能力，下調IL-1、IL-6、TNF-α的表達，發(fā)揮抗炎作用［21］。既往研究發(fā)現，在MS 活躍的病變部位有高水平的TNF-α，TNF-α 的過表達導致局部髓鞘脫失及神經損傷［22］。IL-10 的高表達水平可抑制EAE的炎癥反應，被認為對EAE的恢復起重要作用［23］。本研究發(fā)現，與空白對照組比較，EAE 模型組小鼠發(fā)病高峰期脊髓組織中TNF-α 和IL-10 mRNA升高，這與既往研究相符。經BAI干預后，各組小鼠的TNF-α mRNA 明顯降低，IL-10 mRNA 明顯升高，黃芩素劑量越大，變化越明顯，說明BAI 可抑制TNF-α、促進IL-10 表達，其機制可能與糾正M1/M2型MG失衡有關。

綜上所述，BAI對EAE小鼠發(fā)病具有防治作用，且呈劑量依賴性。其可能的機制是：BAI 可通過促進MG 向M2 型極化，糾正M1/M2 失衡，增加抗炎因子IL-10的表達，減少促炎因子TNF-α的表達，從而抑制炎癥反應，減輕髓鞘脫失，產生神經保護作用。因此，BAI可成為一種治療MS的潛在藥物。但本實驗未進一步研究BAI誘導MG極化的機制，在后續(xù)研究中將進一步探討。