夏天無對坐骨神經痛大鼠巨噬細胞和小膠質細胞活性的影響

★ 鄭雪花 鄒劍芬 黃善敏 何才姑 廖凌虹 董衛國 錢長暉（.福建中醫藥大學中西醫結合學院 福州 35022；2.福建中醫藥大學中醫健康狀態辨識重點實驗室 福州 35022；3.福建中醫藥大學中醫學院 福州 35022）

坐骨神經痛是臨床常見癥狀，由于各種原因導致坐骨神經通路及其分布區失調。神經受壓后局部出現瘀血、水腫，進而引起無菌性的炎性反應，產生的傷害性刺激信息引起外周敏化，繼而信息沿神經通路傳入中樞神經系統，造成中樞敏化，機體出現痛覺異常、痛覺過敏和自發性疼痛等神經功能障礙［1-2］。坐骨神經損傷區的巨噬細胞、脊髓后角的小膠質細胞參與疼痛的發生、發展和持續過程［3-4］。

中藥夏天無是罌粟科植物伏生紫堇的干燥塊莖。其具有止痛、活血化瘀和消炎等功效，在臨床上應用于改善坐骨神經痛［5-7］。前期工作發現夏天無可改善夾傷后坐骨神經運動功能［8］，但其改善坐骨神經痛的作用機制并未明確。本項目建立SD大鼠坐骨神經痛模型，通過夏天無干預后研究受損神經微環境變化，關注損傷區域的巨噬細胞以及脊髓后角的小膠質細胞變化，并分析促炎因子改變情況，初步探討夏天無抑制巨噬細胞和小膠質細胞活性從而改善坐骨神經痛的作用機制。

1 材料

1.1 動物

40只清潔級SD雌性大鼠，體質量為200～220 g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（閩）2012-0001。實驗動物的各項處理程序，符合福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會的有關動物保護和利用的倫理學規定。所有的操作都以盡量減少動物損害為準。

1.2 主要試劑與儀器

夏天無注射液購于江西天施康中藥股份有限公司（批號：Z36020694）；兔抗IBA1多克隆抗體（Wako，日本）；兔抗CD68多克隆抗體（Abcam，英國）；鼠抗TNF-a單克隆抗體（Santa Cruz，美國）；Alexa 488或568熒光標記二抗（Abcam，英國）；防熒光淬滅劑（Vector，美國）；Leica CM 1950恒溫箱冰凍切片機（Leica，德國）；Zeiss Axio Imager A2熒光顯微鏡（Zeiss，德國）。

2 方法

2.1 模型制備及分組

SD大鼠以烏拉坦5 mL/kg行腹腔注射麻醉，于左側后肢股骨近中段斜切，分離并暴露坐骨神經。在其分叉前游離出約0.5 cm，用2根4-0的鉻制羊腸線繞坐骨神經主干做疏松的單結環扎，羊腸線間距約0.5 mm，單結剛好能沿神經滑動，結扎線松緊程度以引起小腿肌肉輕微顫動且不影響神經血液循環為宜。術后無菌生理鹽水沖洗消毒，逐層縫合。術后動物分籠單獨飼養，供給充足食物和水。術后3 d內注射青霉素0.1 mL/次/d，以防傷口感染。動物行坐骨神經痛造模手術后，隨機分為4組，每組動物均為8只：夏天無7 d組和28 d組，術后腹腔注射夏天無注射液，分別于術后7 d和28 d取材；模型7 d組和28 d組，術后以0.9% 生理鹽水進行注射，分別于術后7 d和28 d取材。另設定假手術組（n=8），其僅暴露坐骨神經，不做其它處理。術后以0.9% 生理鹽水進行注射。每只動物注射次數為1次/2 d，每次注射0.2 mL/只，至各時間點結束時，假手術組于第7 d取材。

2.2 行為學檢測

2.2.1 Von Frey針刺實驗采用Von Frey絲檢測大鼠雙側后爪50%縮爪閾值。將大鼠置放于底部為細鋼絲網格的籠中，用不同規格Von Frey絲垂直皮膚緩慢直刺后足掌部，用力使Von Frey絲彎曲并持續6～8 s。造模手術前經Von Frey針刺實驗篩選，通過機械痛覺閾值檢測合格后，才納入實驗進程。

2.2.2 熱敏實驗用局部熱刺痛采集大鼠足底對光熱的刺激痛閾值時間，觀察大鼠肢體的感覺功能。設定溫度為55 ℃，待大鼠靜止時將熱刺痛源置于后肢腳掌，大鼠后肢縮起或出現舔足反應時開始記錄時間，超過40 s無反應則停止刺激。每只大鼠每只腳掌測試3次。造模手術前經熱敏實驗篩選，通過痛覺閾值檢測合格后，才納入實驗進程。

2.3 組織準備

在動物實驗各時間結束點，每組動物以烏拉坦5 mL/kg劑量行腹腔注射，多聚甲醛灌注固定，分離大鼠的左側坐骨神經（以鉻制腸線為中點，剪取約1 cm長度的神經段）、脊髓L4-L6節段。利用冰凍切片機行連續組織切片，脊髓組織行橫切（厚度為16 μm），坐骨神經縱切（厚度為12 μm）。

2.4 Masson染色

取坐骨神經標本，依次經過甲醇 2 min，蘇木精3 min，麗春紅酸性品紅5 min，磷鉬酸2 min，苯胺藍2 min染色后，用甘油封片，鏡檢。

2.5 免疫熒光染色

為了觀察坐骨神經受損微環境的巨噬細胞分布以及脊髓后角的小膠質細胞分布情況，取坐骨神經或脊髓切片，經PBST沖洗后，1% Triton破膜滲透1 h，5%牛血清蛋白（BSA）封閉0.5 h，分別加入1% BSA稀釋的抗CD68、 IBA1或TNF-α的一抗孵育，4 ℃過夜，后加入相應二抗孵育2 h，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核2 min，防熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 Western blotting檢測

每組動物麻醉后，分離坐骨神經（以鉻制腸線為中點，剪取約1 cm長度的神經段）和脊髓左側后角部位。抽提出來的蛋白先通過二辛可寧酸試驗測蛋白濃度。用12%十二烷基硫酸鈉膠分離蛋白。蛋白隨后轉移到PDVF膜，用含有0.5% 吐溫-20的5%牛血清蛋白封閉2 h后，用抗CD68，IBA1或TNF-α的一抗進行4 ℃孵育過夜。接著用HRPconjugated的二抗常溫孵育2 h。免疫蛋白用ECL法檢測。

2.7 測量方法

檢測坐骨神經損傷區的巨噬細胞標記物CD68蛋白和TNF-α促炎因子表達，每個標本以坐骨神經損傷區中心的方形測量區域（300 μm×150 μm），分析區域內CD68蛋白、TNF-α促炎因子的單位面積的平均光密度值。檢測脊髓后角小膠質細胞標記物IBA1蛋白和TNF-α促炎因子表達，每個標本取脊髓后角的3個隨機視野（100 μm×100 μm）作為測量區域，分析區域內IBA1陽性表達細胞數值及TNF-α促炎因子表達平均光密度值。

2.8 數據處理

采用Photoshop 7.0軟件進行圖片處理，Image Pro Plus 6.0進行熒光平均光密度值和Western blotting條帶分析，SPSS 20.0軟件統計學軟件處理數據。計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 機械痛和熱痛閾值比較

神經損傷導致動物痛閾值降低。模型組疼痛閾值降低較明顯，夏天無減輕夏天無組動物的機械痛和熱痛敏感程度，在一定程度上改善坐骨神經痛。兩組間存在著統計學差異（P＜0.05）。見圖1。

圖1 機械痛和熱痛閾值比較

3.2 動物坐骨神經標本觀察及Masson染色結果

模型7 d組、夏天無7 d組均出現神經纖維潰變、斷裂，膠原纖維增多，炎性細胞浸潤等現象。與夏天無7 d組相比，模型7 d組損傷區結構更紊亂，神經纖維間隙的炎性細胞增多。模型28 d組、夏天無28 d組炎性細胞浸潤減少。與夏天無28 d組相比，模型28 d組損傷區神經纖維仍呈現潰變、腫脹等現象，神經纖維間或神經外膜的炎性細胞較明顯。標本觀察可見術后的模型組、夏天無組均出現不同程度的腫脹。但相對于夏天無組，模型組的神經損傷區腫脹更加明顯。Masson染色結果發現，假手術組神經纖維結構齊整連續，周邊結締組織成分少，神經外膜少見炎性細胞。模型組和夏天無組均出現神經纖維潰變、膠原纖維增多和炎性細胞浸潤等現象。與夏天無組相比，模型組損傷區結構更紊亂，神經纖維間隙的炎性細胞增多，膠原纖維成分更無序、粗大、致密，在神經外膜處出現更多的炎性細胞。見圖2。

圖2 動物坐骨神經標本觀察及Masson染色結果

3.3 受損神經的CD68陽性表達的巨噬細胞檢測結果

假手術組CD68標記的巨噬細胞少見。模型7 d組、夏天無7 d組均出現巨噬細胞浸潤。與夏天無7 d組相比，模型7 d組損傷區巨噬細胞數量更多，在神經外膜處巨噬細胞明顯增多。模型28 d組、夏天無28 d組巨噬細胞浸潤減少。與夏天無28 d組相比，模型28 d組在損傷區神經外膜處仍有較多巨噬細胞存在。假手術組巨噬細胞數量少。模型7 d組在損傷區的巨噬細胞CD68表達增強，巨噬細胞數量明顯增加，尤其在神經外膜多見。模型28 d組可見巨噬細胞數量有所減少，但神經外膜仍見較多巨噬細胞。與同時間段的模型組比較，夏天無組巨噬細胞數量明顯減少。各組間存在著統計學差異（P＜0.05）。損傷區的CD68蛋白的Western blotting檢測結果與免疫熒光染色結果趨勢相符（P＜0.05），進一步說明夏天無減少巨噬細胞在損傷區的浸潤。見圖3。

圖3 受損神經的CD68陽性表達的巨噬細胞檢測結果

3.4 各組脊髓后角小膠質細胞標記物IBA1的檢測結果

假手術組的脊髓后角IBA1標記的小膠質細胞數量少，胞體小、突起細長。模型7 d組、夏天無7 d組均出現小膠質細胞增多現象。與夏天無7 d組相比，模型7 d組脊髓后角的小膠質細胞增多明顯，細胞縮短、突起變粗。模型28 d組、夏天無28 d組小膠質細胞數量有所減少。與夏天無28 d組相比，模型28 d組小膠質細胞較多。假手術組的脊髓后角IBA1標記的小膠質細胞數量少，胞體小，突起細長。模型組IBA1陽性表達增強，強于同時間段的夏天無組，小膠質細胞數量增加，細胞形體變粗，突起縮短。組間IBA1陽性表達小膠質細胞數量存在著統計學差異（P＜0.05）。脊髓后角的IBA1蛋白的Western blotting檢測結果與免疫熒光染色結果趨勢相符（P＜0.05），進一步說明夏天無能抑制坐骨神經損傷后的脊髓后角小膠質細胞的應答。見圖4。

圖4 各組脊髓后角小膠質細胞標記物IBA1的檢測結果

3.5 各組坐骨神經損傷區促炎因子TNF-α的檢測結果

免疫熒光結果發現促炎因子TNF-α在假手術組表達較弱，坐骨神經損傷后TNF-α表達增強。相比較于模型組，夏天無組的TNF-α表達無論在受損神經和脊髓后角都明顯減少（P＜0.05）。免疫印跡結果提示在術后7 d，夏天無組比相應的模型組的TNF-α表達明顯減少，但術后28 d，兩組的TNF-α表達水平相似。見圖5。

圖5 各組坐骨神經損傷區促炎因子TNF-α的檢測結果

4 討論

中醫學通常認為坐骨神經痛是“痹癥”，通常由于受壓、外傷等因素致氣血運行受阻，導致瘀血阻滯于局部區域，脈絡不通而產生疼痛［9-10］。在本實驗中，坐骨神經結扎能夠引起坐骨神經痛，在實驗中發現動物行為學得到改善。夏天無干預后，機械痛敏和熱痛敏程度得到緩解，說明夏天無具有改善坐骨神經痛的作用。

由于坐骨神經痛模型大鼠的坐骨神經受損，其內的血管通透性增加，局部組織水腫明顯。《素問·調經論》《景岳全書》等中醫經典理論指出氣血失調是周圍神經損傷的重要病機，提出“血氣不和，百病乃變化而生”“痹者閉也，為氣血為邪所閉，不得通行而病也”等觀點。這些觀點闡述了周圍神經損傷“痹癥”的病機在于氣血運行不暢，由于氣血不和，引起淤結，經脈失養，神經受壓，出現肌體疼痛等感覺功能障礙。一些文獻研究也指出周圍神經損傷病機多為“經絡不通、經氣不續、氣虛血滯”等［11-12］。實驗發現無論損傷后7 d或28 d均可見到夏天無干預后受損神經消腫明顯，體現夏天無具有消腫和化瘀的治療效果。

實驗發現夏天無組的受損神經處的無菌炎性反應不明顯，炎性細胞少，CD68陽性表達的巨噬細胞數量減少。由于炎癥反應能夠加重神經損傷程度。損傷處的巨噬細胞增多，其分泌物質能夠引起神經水腫和神經內環境紊亂等變化［13-15］。由于周圍神經損傷牽涉到中樞神經系統投射區域的應答變化。脊髓后角的“靜止”的小膠質細胞迅速進入“激活”狀態。文獻研究認為小膠質細胞的活化與神經病理性疼痛存在著重要的聯系［16-17］。在實驗中，發現脊髓后角的小膠質細胞應答發生明顯改變。神經損傷導致IBA1陽性表達的小膠質細胞活化，其突起縮短，胞體變粗，細胞數量明顯增多，在夏天無干預后，小膠質細胞的應答，無論是數量或形態的改變都減緩。通過促炎因子的檢測，發現夏天無干預后，受損神經和脊髓后角的促炎因子TNF-α表達減少。促炎因子釋放減少，能夠減少傷害刺激，減緩疼痛。已有文獻也提及夏天無對炎性滲出、炎性介質釋放、肉芽組織增生等有抑制作用，在骨關節痛、類風濕關節炎等方面具有療效［18-19］。

推測由于夏天無有消腫、化瘀、消炎等功效，能夠減少膠原纖維等增生、減少巨噬細胞的趨化或遷移，改善脊髓后角的小膠質細胞的應答狀態，減少促炎因子的釋放，從而使坐骨神經微環境得到一定的改善，起到改善坐骨神經痛的作用。