加米霉素注射液的溶血性與肌肉刺激性試驗研究

江國亮，付良凱，辜質純，李成應，周淑貞

（佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，廣東 佛山 528234）

加米霉素（gamithromycin）是一種半合成、動物專用15 元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素，經(jīng)發(fā)酵和有機合成制備而成。加米霉素的作用機理是選擇性地與細菌核糖體50S 亞基結合，通過阻斷多肽鏈延長抑制細菌蛋白質合成。2008 年，加米霉素被歐洲藥品局（EMA）批準應用于防治溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和睡眠嗜組織菌引起的牛呼吸道疾病。2016年，經(jīng)歐盟批準應用于治療豬由胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌引起的豬呼吸道疾病，并于2017年批準應用于治療羊由節(jié)瘤偶蹄形菌和壞死梭形桿菌引起的傳染性腐蹄病。法國梅里亞公司的加米霉素注射液于2017 年在我國農業(yè)農村部完成進口獸藥注冊，正式進入國內市場合法銷售[1]。同時，國內多個廠家也完成了該產品的研制，獲得新獸藥注冊批準并上市[2]。

加米霉素注射液注射給藥后吸收迅速，生物利用度高，可在肺組織中迅速聚集，組織中藥物濃度遠大于血藥濃度，在靶動物肺組織中維持時間長、藥效持久，具有廣闊的應用前景[3-5]。大環(huán)內酯類藥物肌肉注射給藥容易引起給藥部位的短暫腫脹，并引發(fā)輕微疼痛[6]。因此，為評估加米霉素注射液的安全性，本研究對加米霉素注射液進行溶血性試驗和注射給藥部位刺激性試驗，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品與試劑

加米霉素注射液（規(guī)格：100 mL∶15 g，批號：20210401B，含量：100.4%），由佛山市南海東方澳龍制藥有限公司提供；0.9%氯化鈉注射液（規(guī)格：100 mL∶0.9 g，批號：5220050330，廣東利泰制藥股份有限公司）；甲醛溶液（規(guī)格：2.5 L/桶，批號：C13066534，上海麥克林生化科技有限公司）；10%福爾馬林溶液。

1.2 試驗動物

試驗動物選擇19 只新西蘭白兔（普通級），體重2.0～2.5 kg，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（粵）2019-0035。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶血性試驗

選擇1 只試驗兔心臟采血約50 mL，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10 min，除去纖維蛋白原，制成脫纖血液。加入約10 倍量的0.9%氯化鈉注射液搖勻，1 500 r/min 離心15 min，除去上清液，重復洗滌，得到沉淀的紅細胞。將所得紅細胞以0.9%氯化鈉溶液配制2%的混懸液。取7支試管并編號，分別加入相應量的0.9%氯化鈉注射液、蒸餾水、2%紅細胞混懸液和加米霉素注射液。各試管添加物質及體積見表1。

各試管搖勻，37 ℃恒溫孵育，分別于15、30 min 以及1、2 和3 h 觀察溶血情況并記錄結果。若試管中的溶液為澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留，表明有溶血發(fā)生；若紅細胞全部下沉，上清液體無色澄明，表明無溶血發(fā)生。若溶液中有紅棕色或棕紅色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細胞凝聚發(fā)生；若有紅細胞凝聚的現(xiàn)象，需進一步將凝聚物放在載玻片上，在蓋玻片邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉注射液，置顯微鏡下觀察，凝聚紅細胞能被沖散者為假凝聚，不被沖散者為真凝聚。

表1 溶血性試驗各試管添加物質及體積Tab.1 Substances and volume of each test tube in hemolytic test

表2 肌肉刺激反應分級Tab.2 Response grade of muscle irritation test

表3 肌肉刺激反應分值和等級Tab.3 Response score and level of muscle irritation test

18 只試驗兔隨機分為3 組，分別為低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組6只兔子。低、中、高劑量組的給藥劑量分別為0.25、0.50 和1.00 mL。試驗兔保定后，去毛、消毒，分別于左側股四頭肌注射不同劑量的加米霉素注射液，右側股四頭肌注射等體積0.9%氯化鈉注射液為陰性對照組。給藥后2、4、24和48 h觀察局部反應情況，包括充血、血腫等。

分別于給藥后2、14 d耳緣靜脈注入空氣處死動物（每個時間點各3只），解剖取出兔股四頭肌，觀察注射給藥局部的刺激反應，換算相應的反應級。10%福爾馬林浸泡固定，制作病理切片，顯微鏡下觀察股四頭肌的炎性細胞浸潤、增生、壞死情況。評價該藥的刺激反應，計算肌肉刺激性總反應級，計算平均值并判定刺激等級。

2 結果與分析

2.1 加米霉素注射液溶血性試驗結果（見圖1）

由圖1 可知，含不同濃度加米霉素注射液的1～5 號試管中紅細胞于3 h內全部下沉，上清液體澄明，未見溶血現(xiàn)象，與6號試管現(xiàn)象一致。7號試管管底無紅細胞，試管中的溶液為澄明紅色，即發(fā)生溶血現(xiàn)象。

2.2 加米霉素注射液肌肉刺激性試驗結果（見圖2～圖4、表4）

圖1 加米霉素注射液溶血性試驗結果Fig.1 Result of gamithromycin injection hemolysis test

由圖2可知，試驗新西蘭兔肌注加米霉素注射液后2、4、24和48 h肉眼觀察注射部位情況。結果顯示，各劑量組試驗兔各時間點注射部位均未發(fā)現(xiàn)充血、紅腫等變化，試驗兔活動正常。

圖2 加米霉素注射液肌肉刺激性試驗結果（表觀）Fig.2 Result of gamithromycin injection muscle irritation test（apparent）

由圖3 可知，對給藥后2、14 d 的各試驗組新西蘭兔注射部位進行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)陰性對照組和低劑量組注射部位股四頭肌均無明顯異常。

中劑量組給藥后2 d時，注射部位出現(xiàn)輕度充血現(xiàn)象；14 d時可觀察到有組織增生的修復現(xiàn)象。

高劑量組給藥后2 d時，注射部位出現(xiàn)重度充血現(xiàn)象，伴有肌肉變性；14 d 時可觀察到中心病灶出現(xiàn)局部變性、壞死情況。

由圖4 可知，對給藥后2、14 d 的各試驗兔注射部位進行肌肉組織病理學檢查，發(fā)現(xiàn)陰性對照組和低劑量組注射部位肌細胞排列緊密，著色均勻，界限清晰，胞核位于邊緣，肌細胞聚集成束，肌束由疏松結締組織構成的肌束膜包裹，組織未見明顯異常。

中劑量組給藥后2 d 時，肌肉組織出現(xiàn)少量肌細胞壞死，細胞碎裂，胞核溶解，伴少量上皮樣細胞增生，少量炎性細胞浸潤。14 d 時可見有局部肌細胞壞死，胞核溶解，伴炎性細胞浸潤，可見較多新生毛細血管。

高劑量組給藥后2 d 出現(xiàn)組織大片壞死，并可見輕度鈣化，壞死灶內較多炎性細胞浸潤，可見較多上皮樣細胞增生，呈輕度充血。14 d 時可見存在大量肌細胞壞死、胞核溶解，少量肌細胞壞死后鈣化，并被多核巨細胞包裹，形成肉芽腫；大量壞死肌纖維溶解，被大量新生肉芽組織取代，肉芽組織內可見大量新生結締組織以及較多的新生毛細血管。

圖3 加米霉素注射液肌肉刺激性試驗結果（剖檢）Fig.3 Result of gamithromycin injection muscle irritation test（necropsy）

圖4 加米霉素注射液肌肉刺激性試驗結果（病理切片）Fig.4 Result of gamithromycin injection muscle irritation tes（tpathological section）

由表4可知，根據(jù)表2、表3判定標準，判定陰性對照組和低劑量組無明顯肌肉刺激性，中劑量組為輕微肌肉刺激性，高劑量組則為中度肌肉刺激性。

結果表明，肌肉注射低劑量加米霉素注射液不產生刺激性反應，隨著注射劑量增加，刺激性反應等級增加，刺激性反應表現(xiàn)的局部損傷可逐漸自行修復。

表4 加米霉素注射液肌肉刺激性反應評分與等級Tab.4 Response score and level of muscle irritation test about gamithromycin injection

3 討論

注射液為高風險藥品，給藥后可能引起免疫性或非免疫性溶血。因此，在研制注射液時需要觀察該藥品是否可能引起溶血和紅細胞凝集反應。注射液的肌肉刺激性試驗是為了觀察肌肉組織在局部注射給藥后是否引起紅腫、充血、浸出、變性或壞死等局部反應，并評估其刺激性反應的可逆程度，以確保臨床用藥安全[7]。

加米霉素注射液的急性毒性試驗表明，小鼠皮下注射的半數(shù)致死量（LD50）為1 094.2 mg/kg BW[8]，大鼠經(jīng)口染毒的LD50為2 219.14 mg/kg BW[9]，屬低毒性藥物。本研究的溶血性試驗中，加米霉素注射液在3 h 內對兔紅細胞不產生溶血和凝聚反應，說明加米霉素注射液可應用于注射，試驗結果與張倩[10]、張云茜等[11]研究結果一致。

肌肉刺激性試驗的注射劑量一般可采用高于或等于臨床劑量，也可考慮試驗動物所能承受的容量以及用量對肌肉組織產生張力等影響因素對劑量進行調整，一般一次最大劑量不超過1 mL[12]。目前，有報道的關于注射液肌肉刺激性試驗中，更傾向采用最大劑量的1 mL 進行考察[13-15]。該條件對藥物的安全性要求更高，更利于指導臨床安全用藥。

本研究中，肌刺激性試驗的低劑量組注射量約為推薦劑量的3倍，中劑量組約為推薦劑量的6倍。結果表明，低劑量加米霉素注射液對家兔給藥部位股四頭肌無明顯肌肉刺激性，中劑量為輕微刺激性，高劑量則顯示為中度刺激性，但肌肉組織病變可逆，試驗結果與法國梅里亞原研產品在歐洲藥監(jiān)局公布的注冊資料信息一致。資料顯示，加米霉素注射液對新西蘭兔存在輕微刺激性[3]，且在不良反應監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，給藥后注射部位可能出現(xiàn)腫脹，通常于注射后2～4 d內消退[16]。

張云茜等[11]進行加米霉素注射液肌肉刺激性試驗研究時，給藥劑量分別為1倍（6 mg/kg BW）、3倍和5倍推薦劑量，結果顯示，加米霉素注射液對新西蘭兔肌肉無刺激性。張倩等[10]研究顯示，注射劑量為1 mL 的注射部位出現(xiàn)明顯出血斑，但病理切片分析并未發(fā)現(xiàn)異常。

本試驗研究結果與上述試驗報道結果相似，其中的差異可能是由試驗條件和受試物不同造成。因此，可推測加米霉素注射液肌肉注射給藥具有一定刺激性可能是其固有特性。

4 結論

加米霉素注射液溶血性符合注射液要求，低劑量肌肉注射具有較好安全性，高劑量肌肉注射則具有一定刺激性。本品在臨床應用中應用于治療敏感菌引起的豬、牛呼吸道疾病以及羊的腐蹄病，可通過肌肉注射給藥，臨床應用時建議避免于同一部位大劑量注射給藥，應根據(jù)不同給藥對象的實際情況多點給藥，降低對肌肉組織的刺激。