新型鵝細小病毒病研究進展

劉明生，甘輝群，吳 雙，傅宏慶，鐘美娟

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300）

新型鵝細小病毒病是由新型鵝細小病毒（novel goos e parvovirus，NGPV）引起的一種病毒性傳染病，又稱短喙侏儒綜合征（short beak and dwarfism syndrome，SBDS），主要感染櫻桃谷北京鴨、番鴨、半番鴨等。新型鵝細小病毒病臨床可表現為短喙、舌頭外伸、腿骨易折斷、生長發育受阻、死亡等，其病原除NGPV外，還包括新型番鴨細小病毒（novel muscovy duck parvovirus，NMDPV）、鴨圓環病毒（duck circovirus，DCV）等。

1971 年，法國率先報道了新型鵝細小病毒病，之后在我國臺灣地區以及波蘭、匈牙利相繼出現相關報道[1-2]。2015年，我國福建、江蘇、山東等地區的一些商品肉鴨群中出現鴨喙變短、長舌、生長遲緩等癥狀的“鴨大舌病”，經病原分離鑒定證實該病為新型鵝細小病毒病[3-4]。本文綜述新型鵝細小病毒的病原學特征、分子生物學特征、臨床診斷特征和檢測技術等方面的相關研究，以期為新型鵝細小病毒病的綜合防控提供技術支撐。

1 病原學特征

NGPV 屬細小病毒科（Parvoviridae）、細小病毒亞科（Parvovirinae）、依賴病毒屬（Dependovirus），為二十面體對稱的球形或六角形、無囊膜、單鏈DNA 病毒，直徑為20～25 nm[5-6]。與其他病毒相比，該病毒體積相對較小，結構較簡單。NGPV 一般無法在PK-15、DF-1、BHK-21 等常用的細胞系上生長增殖，但可采用鴨胚、鵝胚[7-8]或其原代成纖維細胞分離。病毒初期對鴨胚致死率低，一般需要盲傳幾代后才可導致鴨胚出現死亡；死亡時間多發生于接種病毒后96～120 h，表現為胚體頭頸部、胸腹部、腿部和翅下出血，病毒滴度（ELD50）可達10-5.5～10-4.2/0.2 mL[9-10]。賈婧宇等[8]從分離得到3 株NGPV，結果發現，3 種NGPV 均能夠在鵝胚中穩定傳代，但致死鵝胚的時間明顯長于經典型鵝細小病毒（GPV）。

2 分子生物學特征

2.1 基因組結構

NGPV的基因組序列約為5.1 kbp[5,7,10-11]。鄭肖強[12]分離得到的NGPV SDLC01 株基因組全長5 006 bp，基因組兩側為末端重復序列（inverted terminal repeat，ITR），長度約為444 個核苷酸（nucleotide，nt）。ITR 區含有大量核苷酸為4～10 bp的短小重復序列，利于病毒復制、轉錄以及克隆載體拯救。基因組中間部分含左、右兩個開放閱讀框（open reading frame，ORF），ORF中間由18個堿基隔開；其中，左側ORF 能夠編碼NS1 和NS2 非結構蛋白，右側ORF則可編碼VP1、VP2和VP3等3種結構蛋白。

非結構蛋白NS1，又稱為Rep1 蛋白，是在NGPV 病毒粒子復制早期時產生的一種具有調節作用的磷酸化蛋白，參與病毒的DNA 復制、誘導細胞的病理變化以及基因的轉錄調控等[13]；含有ATP酶活性結合點、4個保守的解旋酶活性堿基，具有與ATP 結合或與DNA 定向結合并切割等多種生物學功能[14]。

非結構蛋白NS2，又稱為Rep2蛋白。NGPV分離株的NS2基因核苷酸與GPV分離株同源性很高，對細小病毒的毒力無太大影響[12]。但NS2 蛋白能夠增強NS1 蛋白的細胞毒性作用，與病毒DNA的合成、增殖以及蛋白質的有效合成有關[15]。Cotmore 等[16]發現，缺失NS2基因的病毒在合成病毒衣殼蛋白時影響病毒的組裝。

結構蛋白是病毒衣殼的組成成分，包括VP1、VP2、VP3，長度分別為2 199、1 764 和1 605 bp[12]。結構蛋白具有各自的轉錄起始位點，但具有共同的轉錄終止位點。其中，VP1結構蛋白影響病毒的感染過程；VP2結構蛋白參與病毒顆粒的細胞核輸出，能夠刺激機體產生保護性抗體；VP3含有細小病毒主要的抗原決定簇，構成鵝細小病毒的保護性抗原，是細小病毒主要的結構蛋白[17]，參與病毒感染宿主細胞環節。

曹旭陽[14]采用PCR擴增NGPV的VP3基因，連接至原核表達載體pCold-TF，轉化入E.coliBL21感受態細胞，高效表達重組蛋白VP3，采用Western blot和間接免疫熒光進行鑒定，表明重組蛋白VP3可與新型鵝細小病毒的特異單抗發生特異性免疫反應。

2.2 核苷酸序列

2015 年，NGPV 引起SBDS 發病。不同NGPV 的分離株間全基因序列相似性為99.2%～99.7%，與經典的鵝細小病毒（GPV）核苷酸同源性達92%以上，與番鴨細小病毒（MDPV）核苷酸同源性普遍低于90%[8,11,18-20]。賈婧宇等[8]分離得到的3 株NGPV 基因組的同源性為98.9%～99.7%，與經典GPV強毒株的同源性為95.2%～96.1%。

李琦等[10]對分離的新型番鴨細小病毒DS15株進行全基因序列分析，結果發現，新型番鴨細小病毒DS15 株與NGPV SDLC01 株同源性為99.8%，與其他GPV 同源性達92.6%～97.2%，與番鴨MDPV 同源性為81.2%～85.4%。葛志琪[11]對分離的NGPV 四川株SC16株進行基因組核苷酸同源性分析，結果顯示，NGPV 四川株SC16 株與SDLC01及QH15 株的同源性均高達99%。吳蓓[18]分離的NGPV DZ-01株的全基因組序列與其他NGPV相比，其同源性達99.3%～100.0%，其中，DZ-01 與QH15 株、SDLC01 株同源性分別為99.7%和100.0%；與MDPV 相比，同源性最高僅為85.0%。

殷冬冬等[19]分離鑒定了1 株NGPV AH-D15 株，對其VP3基因進行測序，結果發現，AH-D15株核苷酸同源性與經典GPV相比，同源性達93.3%～96.5%，親緣關系較近；與MDPV 同源性為81.6%～81.7%，親緣關系較遠。寧康[20]通過對11份NGPV 陽性樣品基因序列分析，結果發現于443 bp的VP1和495 bp的VP3區，其所測毒株間的核苷酸序列同源性均達100%，與經典GPV 毒株核苷酸同源性分別為95%～99%和96%～99%。

2.3 NGPV關鍵突變位點分析

賈婧宇等[8]基于3 株NGPV 與已發表的NGPV 毒株和經典GPV 強毒株的編碼蛋白比對分析顯示，與國內經典GPV強毒株相比，NGPV毒株結構蛋白VP1共產生了16個氨基酸點突變，其中9個氨基酸位點與歐洲的B株相同；非結構蛋白Rep1 則產生了12 個氨基酸位點突變，上述特征性氨基酸位點可能與GPV 從感染鵝轉向感染新宿主櫻桃谷鴨相適應。寧康[20]研究表明，北京鴨源GPV的非編碼區存在堿基突變和插入或缺失，但對結構形成無影響；NS蛋白編碼區含9個共性氨基酸突變，可能與GPV對北京鴨的致病性有關；VP1蛋白含5個共性氨基酸突變，但這些突變均遠離可能的受體吸附位點，不影響病毒與受體的結合。

3 臨床診斷特征

3.1 流行病學

NGPV 的易感動物主要包括3 周齡以內的櫻桃谷鴨、北京鴨、半番鴨、高郵鴨、臺灣白鴨與金定鴨等肉鴨，發病率為10%～30%，部分品種可高達50%；自然感染病死率一般低于5%，人工感染病死率則可達25%。NGPV能夠通過接觸傳播和垂直傳播，病毒廣泛存在于鴨心、肝、脾、肺、腎等器官。

傅宏慶等[6]證實，NPGV可感染高郵鴨、金定鴨與蘇郵1 號鴨，發病率100%，死亡率10%～25%。吳蓓[18]研究表明，可從感染NGPV 的患鴨的心、肝、脾、肺、腎、胸腺、胰腺、膽汁、法氏囊等9個臟器中檢出病毒，病毒核酸檢出率最低為肺臟（15.0%），最高為心臟（82.5%），平均檢出率為45.0%；鴨群的陽性檢出率為62.5%～100.0%，平均檢出率達82.5%。寧康[20]采集了來自不同地區8 個孵化場的1 日齡北京鴨樣品40份，經檢測發現GPV陽性樣品為35份，陽性率達87.5%，結果表明，NGPV病毒可經卵垂直傳播。

3.2 臨床癥狀

櫻桃谷鴨、北京鴨等商品肉鴨感染NGPV 后，患鴨表現鴨喙短縮、舌頭外伸、脛骨變脆、跛行癱瘓、生長遲緩、體重減輕、腹瀉拉稀及腿翅易斷等。NGPV可造成患鴨采食困難，料重比增加，降低養殖經濟效益[3]。NGPV發病率與日齡存在一定關系，發病鴨群日齡越小，發病率越高。

陳浩等[3]將分離鑒定的NGPV SDLC01 株感染1 日齡雛鴨，結果表明，GPV SDLC01 毒株可引起患鴨上下喙萎縮、舌頭外伸、體溫升高、排白色或黃白色稀便，部分患鴨出現運步困難、跛行或癱瘓等癥狀；發病率5%～20%，嚴重者高達40%，但患鴨病死率較低；患病鴨日齡多為13～40 d，體重減輕20%～30%，嚴重者可減輕50%。劉榮昌等[5]測量患病的3個半番鴨群與同場的外觀正常鴨的體重、喙長、喙寬，結果顯示，與正常鴨相比，發病鴨體重減輕49%，喙長縮短32%，喙寬縮短22%。

李琦等[10]使用鴨胚傳代尿囊液接種雛鴨，結果發現，雛鴨表現喙變短、舌頭外伸的臨床癥狀。袁萬哲等[21]以口服和肌肉注射的方法，將分離鑒定的SD1株病毒的第5代尿囊液分別接種于10日齡的北京4系與櫻桃谷肉鴨，結果表明，感染組鴨群出現體重減輕、脛骨較脆等癥狀，部分櫻桃谷肉鴨表現喙萎縮、舌頭外伸等癥狀，并能夠從感染組鴨群的心、肝、脾、肺、腎、胸腺、舌中檢出鴨細小病毒。張錦玥[22]采用肌肉注射的方法，將分離鑒定的NGPV SD15株接種于40只1日齡櫻桃谷鴨，結果表明，與對照組相比，感染6 w后，感染組鴨的體重減輕18.5%，喙長縮短10.7%。

3.3 病理變化

患病鴨通常表現為上下喙短縮，舌頭僵硬而不靈活，可向外伸出1～3 cm。患鴨骨骼發育異常，全身骨質疏松、骨質脆弱，容易斷裂；胸腺萎縮,出現散在的針尖狀出血；心肌出現少量出血點，肝臟輕微出血，患鴨胸腺髓質的胸腺小體出血，胸腺皮質出血少見，心肌顆粒變性，骨骼肌出血，肌纖維斷裂，發凝固性壞死，肝細胞呈水泡變性[5]。

陳浩等[3]光學顯微鏡下觀察了短喙長舌綜合征患鴨的舌、胸腺、腎臟等器官的組織病理學變化，結果發現，患鴨舌間質性炎癥，結締組織基質疏松、水腫，胸腺水腫，胸腺髓質淋巴細胞與網狀細胞散在性壞死，存在大量炎性細胞浸潤，組織間質出血，腎小管上皮細胞崩解凋亡，管腔狹小、水腫，間質出血，并伴有大量炎性細胞浸潤。張錦玥[22]通過HE 染色觀察組織病理學變化，發現感染組鴨的肝細胞輕度水腫、空泡變性，脾臟髓質區脾小體明顯減少，淋巴細胞明顯減少。張欣欣[23]研究發現，鴨感染鴨源新型鵝細小病毒可造成腸絨毛嚴重受損、肝細胞變形壞死，腎小管呈空泡化。

4 檢測技術

新型鵝細小病毒的檢測方法為核酸探針檢測方法、半套式PCR、套式PCR、熒光定量PCR、實時等溫環介導擴增方法、間接ELISA方法等。

鄭肖強[12]建立了地高辛標記核酸探針檢測方法，該法敏感性好，最低檢測量為25 pg，與其他常見鴨源病毒無雜交反應，特異性強。高莎莎[24]建立了半套式PCR 檢測方法，對鵝細小檢測陽性的病料進行檢測驗證，結果表明，半套式PCR 檢測法的檢出率為73.3%～93.3%。Li 等[25]建立了雙重半巢式PCR檢測方法，可同時鑒別檢測經典鵝細小病毒和新型鵝細小病毒。周潔文等[26]建立了檢測新型鴨細小病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，結果顯示，在5.17×101～5.17×107copies 范圍內呈良好的線性關系，相關系數R2為0.999、斜率為3.595，靈敏度可達5.17 copies。

曹旭陽等[27]建立了TaqMan 熒光定量PCR 方法，結果表明，此方法檢測敏感性達37.2 copies/μL，與常規PCR 相比，靈敏度高100倍，具有良好的特異性，批內和批間的檢測變異系數均不大于2.2%；對收集的50份病料進行檢測，熒光定量PCR方法NGPV檢出率為78%，普通PCR方法為50%。Yang等[28]建立了實時等溫環介導擴增方法，結果表明，該法靈敏度高，最低檢出量為100 copies，是普通PCR靈敏度的100倍。

王燕[29]建立了基于VP3 蛋白檢測新型GPV 抗體的間接ELISA方法，研究表明，該法有高靈敏度和特異性，待測血清10 240 倍稀釋后仍可檢出GPV 特異性抗體。劉銘等[30]建立了間接ELISA方法，其檢測臨界值為0.445，該方法具有較好的特異性、敏感性和重復性，臨床樣品的陽性檢出率為93.3%。

5 防控技術

目前尚無針對SBDS 的商品疫苗，本病的防控主要依靠對1～7日齡雛鴨注射小鵝瘟卵黃抗體，但并不具有良好的預防、治療作用。

劉銘等[31]采用自制的新型鴨細小病毒（SD株）疫苗免疫蛋雞，采用水稀釋-硫酸銨二次沉淀法制備了大量純凈的卵黃抗體，效價達1∶10 000，為新型鴨細小病毒病的防治提供了新思路。有研究人員采用傳統鴨胚或鴨胚成纖維細胞培養病毒制備滅活疫苗，通過免疫種鴨的方式使雛鴨獲得母源抗體[32]。與抗體產品相比，該產品保護率高、母源抗體持續時間長，僅免疫母鴨可節約勞動力和成本，具有一定優勢。但全病毒滅活疫苗開發難度較大、成本高，更適宜的防治方式仍有待探索。

6 結論

新型鵝細小病毒病的臨床表現以短喙、舌頭外伸、腿骨易折斷、生長發育受阻和死亡為特征，其病原為NGPV，與經典的GPV核苷酸同源性達92%以上。目前尚無針對新型鵝細小病毒病的特效療法，對該病的防治仍迫切需要研制保護率高、成本低、生物安全風險小且副反應少的生物制品。