2 例金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎分離鑒定及藥敏試驗

張國華，呂思文，金振華，王麗坤，張 瑩，張 備，李 燁，薛沾枚

（1. 黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 116000；2. 齊齊哈爾市龍沙區農業綜合行政執法大隊，黑龍江齊齊哈爾 116000）

奶牛乳房炎是奶牛養殖業中的常見病[1]，可導致奶牛產奶量下降，影響乳制品品質，也可能對消費者的身體健康造成不良的影響，對養殖業造成很大的經濟損失[2]。奶牛乳房炎可能由多種因素引起，其中細菌對該病的發生影響很大。引起奶牛乳房炎較為多見的致病菌為大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌等[3]，以金黃色葡萄球菌較為常見。目前，對奶牛乳房炎多采用常規的抗生素進行治療，極易產生耐藥性，導致奶牛乳房炎難以治愈。

黑龍江主要養殖的奶牛品種為中國荷斯坦奶牛、西門塔爾牛等，奶牛存欄量居全國前列，且每年保持著較大增幅。乳房炎嚴重影響本地奶牛養殖業發展，如何有效治療奶牛乳房炎是畜牧從業者需要深入研究的熱點問題。為避免出現耐藥性，應杜絕盲目使用抗生素，可采用無抗飼養模式提高奶牛的抵抗力，抵御疾病發生。若發生奶牛乳房炎，應使用科學合理的手段對疾病進行診療，確定感染細菌的種類，針對不同的細菌精準用藥可有效治療疾病，降低疾病造成的損失[4]。黑龍江地區某奶牛養殖場發生奶牛產奶量下降、體細胞數明顯上升、產奶中帶血等情況。本試驗對該場發病奶牛的乳樣進行細菌分離培養，對分離菌株進行生化試驗、16S rDNA 鑒定、基因序列比對分析、藥物敏感性試驗等，并給出針對該細菌的敏感性藥物，指導臨床用藥，為奶牛乳房炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集黑龍江地區某奶牛養殖場2例乳樣。清洗消毒病牛乳頭，棄去20 mL乳樣，無菌采集5 mL乳液取回，進行細菌分離鑒定。昆明小鼠購自齊齊哈爾醫學院。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：血平板培養基（青島海博生物技術有限公司）、革蘭氏染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）；藥敏片、細菌微量生化管（杭州微生物試劑廠），DP302 DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR exTap Master Mix（大連寶生物工程有限公司）。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

主要儀器：2720PCR 儀（美國ABI 公司）、凝膠成像系統和電泳儀（北京六一儀器設備廠）、BHC-1300IIA生物安全柜（蘇州凈化設備有限公司）、恒溫培養箱（上海一恒儀器設備公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌的分離和培養

將取回的乳液于無菌環境下操作，13 000 r/min 離心10 min，取下層沉淀100 μL接種于血平板培養基，37 ℃培養16 h，進行革蘭氏染色，觀察細菌形態。

1.3.2 生化試驗

將分離到的細菌根據鏡檢結果進行初步判斷，進行生化試驗確認細菌的種類。

1.3.3 16S rDNA鑒定（見表1）

表1 16S rDNA引物Tab.1 16S rDNA primer

提取細菌DNA，16S rDNA 引物根據參考文獻[5]進行設計。擴增產物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，與預期結果相符后將膠回收產物送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，測序結果于GENEBANK上進行比對分析。16S rDNA引物見表1。

1.3.4 動物試驗

采用滅菌的吸頭點取單菌落，接種于營養肉湯培養基，加入5%犢牛血清，37 ℃培養16～24 h，制備單位濃度為3×108CFU/mL的菌液。

取15只昆明小鼠進行試驗，試驗組小鼠腹腔注射菌液0.3 mL/只，每個菌株注射5 只昆明小鼠。設置1 個對照組注射等量的營養肉湯培養基，觀察試驗驗組和對照組小鼠是否出現死亡或發病癥狀。對接種細菌后發生感染死亡的小鼠臟器內的細菌進行分離鑒定。

1.3.5 藥敏試驗

試驗根據美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）（2017）推薦的K-B紙片法進行操作實施[6]。選取丁胺卡那、恩諾沙星、環丙沙星、多西環素、鏈霉素、頭孢噻肟等6 種藥敏片，將細菌均勻涂布于血平板，37 ℃培養16 h，觀察藥物敏感性試驗結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養結果

將分離得到的兩株菌株命名為HQ-1、HQ-2，分別接種于血平板培養16 h，菌落均呈為光滑、濕潤、微微隆起的水珠樣菌落。革蘭氏染色顯示分離株為革蘭氏陽性菌，細菌呈球狀，單個或幾個在一堆、或呈葡萄串狀，可初步判定分離得到的細菌為金黃色葡萄球菌。

2.2 生化試驗結果（見表2）

表2 生化試驗結果Tab.2 Biochemical tests results

由表2可知，兩株菌株均能夠發酵蔗糖、蕈糖、乳糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、葡萄糖；無法發酵山梨醇、木糖醇。尿素酶試驗、VP、甲基紅試驗陽性；無法還原硝酸鹽。過氧化氫酶試驗有氣泡產生，呈陽性。參照《伯杰氏系統細菌學手冊》，生化鑒定結果與金黃色葡萄球菌特性相符，確定兩株分離株均為金黃色葡萄球菌。

2.3 16S rDNA PCR鑒定結果（見圖1）

圖1 16S rDNA PCR鑒定結果Fig.1 16S rDNA PCR results

由圖1可知，2株菌株經DNA提取、PCR鑒定擴增出兩條長度約1 465 bp 的特異性條帶。將PCR 產物送至庫美進行測序，序列結果經比對，與ATCC12600 株（NR_118997）同源性分別為95.56%、96.38%。

2.4 動物致病性試驗結果

菌液接種24 h后試驗組小鼠全部死亡，對照組小鼠正常。對死亡小鼠進行剖檢，發現小鼠肝臟腫大；將試驗組小鼠的肝臟于無菌環境下采集樣本，進行細菌分離鑒定，顯示分離得到的細菌與原細菌為同種細菌；進行單菌落DNA提取以及擴增、測序，結果顯示與原細菌相同。

2.5 藥敏試驗結果（見表3）

表3 分離菌株的藥敏試驗結果Tab.3 Results of isolated strains susceptibility test

結果根據CLSI的指導判定為藥物敏感（S）、中等敏感（I）、耐藥（R）[4]。由表2可知，兩株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗結果一致，均對丁胺卡那這類抗生素有較高的敏感性，對恩諾沙星、環丙沙星中介，對多西環素、鏈霉素、頭孢噻肟耐藥。

3 討論

葡萄球菌作為一種環境中常在菌類，由于環境等因素變化，可能引發致病性，對人類和動物養殖業的安全均具有一定影響[7]。如奶牛感染葡萄球菌可引起乳房炎等多種疾病，嚴重危害奶牛養殖業的健康有序發展[8-10]。本試驗通過對黑龍江地區兩例奶牛乳房炎樣本進行分離鑒定，確定引起乳房炎的致病菌為金黃色葡萄球菌，與ATCC12600株（NR_118997）同源性高達95.56%～96.38%；藥物敏感性試驗篩選此菌株敏感性藥物為丁胺卡那，進行治療后效果顯著，發病奶牛癥狀迅速消退。藥敏試驗結果顯示，分離株多西環素、鏈霉素、頭孢噻肟耐藥，說明HQ-1、HQ-2 株細菌對于抗生素已產生了一定耐藥性。研究發現，若奶牛發生乳房炎等疾病，應查找病因并運用現代診療方案對疾病進行精準的治療和有效的預防[11]，切忌盲目用藥。盲目用藥可能導致病程加長[12]、治療效果不佳、經濟損失加重等不良后果。

董志民等[13]在東北地區3 個規?；膛ｐB殖場對330 份樣本進行檢測，分離得到表皮葡萄球菌32 株、腐生葡萄球菌34株，所得菌株對青霉素、苯唑西林和林克霉素的耐藥率較高。劉通等[14]對黑龍江某規?；膛ｐB殖場急性乳房炎樣本進行分離鑒定，結果顯示，葡萄球菌單獨感染1例，葡萄球菌和鏈球菌混合感染4例，葡萄球菌和酵母菌混合感染2例，感染葡萄球菌樣本占總樣本數的70%。張艷等[3]對黑龍江某規?；膛ｐB殖場乳腺炎樣本進行分離鑒定，結果顯示，分離得到大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和蠟樣芽孢桿菌，所得菌株對環丙沙星和左氧氟沙星高度敏感。

因此，葡萄球菌在東北地區奶牛乳房炎的感染較為多見，且均產生了不同程度的耐藥性。為增加養殖戶的收益，降低奶牛乳房炎造成的經濟損失，應加強飼養管理，定期進行環境消毒及牛群免疫[15]，保證飼料質量且飼喂營養全面的飼料[16]。若發生疾病，應運用科學合理的手段進行治療，避免長期使用單一藥物引起耐藥性[17]，為助力養殖業健康有序的發展做出貢獻。

4 結論

本試驗采集的2 份乳房炎樣本，符合金黃色葡萄球菌的形態鑒定，鏡檢可見葡萄串狀的球形革蘭氏陽性菌。生化試驗結果符合金黃色葡萄球菌生化特性；16S rDNA 序列鑒定擴增得到大小為1 465 bp 左右的特異性條帶，與ATCC12600 株（NR_118997）同源性為95.56%、96.38%，確認分離株金黃色葡萄球菌HQ-1、HQ-2。通過動物試驗說明兩株細菌均具有較強的致病性。藥敏結果顯示，分離株對丁胺卡那敏感。通過試驗確認本次奶牛乳房炎為感染金黃色葡萄球菌引起，為黑龍江地區奶牛乳房炎的治療做出指導，為未來奶牛乳房炎的研究提供參考。