邯鄲地區規模化牛場犢牛隱孢子蟲感染情況調查

龐維鵬，施宇博，錢常歡，孔 博，李亞琪，方素芳，崔 平

（河北北方學院動物科技學院，河北 張家口 075000）

隱孢子蟲病是一種由隱孢子蟲引起的人畜共患原蟲病[1]。目前，已有37個隱孢子蟲的有效種得到鑒定。牛可感染4個有效種：牛隱孢子蟲、瑞氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲[2-4]。安氏隱孢子蟲于胃內寄生，其余3種隱孢子蟲則寄生于腸道[5]，上述隱孢子蟲均可引起腸和胃黏膜損傷，降低胃腸道吸收功能，進而導致腹瀉。隱孢子蟲被認為是全球水媒和食源性腹瀉疾病暴發的常見原因[6-7]。因此，隱孢子蟲的防治尤為重要。國內關于隱孢子蟲流行病學調查結果顯示，同一奶牛場內斷奶前犢牛感染率高于其他年齡段奶牛[8-9]。犢牛感染隱孢子蟲的主要表現為精神沉郁、厭食和腹瀉，嚴重可導致死亡；糞便呈灰白色或黃褐色，含有大量纖維素、血液和黏液，后期呈透明水樣糞便[10]。

為全面準確地調查邯鄲市地區奶牛隱孢子蟲感染的種類和流行病學情況，本試驗以邯鄲5 個縣（區）養殖場的犢牛為研究對象，通過分析邯鄲不同地區和不同月齡犢牛感染隱孢子蟲的感染情況，評價隱孢子蟲對邯鄲地區犢牛的影響，為控制隱孢子蟲病的傳播情況提供參考，對邯鄲市地區畜禽的健康具有重要的公共衛生學意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年1 月至5 月，從邯鄲5 個縣（區）的養殖場隨機采集犢牛的新鮮糞便400份（成安縣、魏縣、臨漳縣以及邯山區、肥鄉區各80 份）。其中0～3 月齡犢牛糞便樣品數量為240 份，4～6 月齡犢牛糞便樣品數量160 份，每份樣品10～50 g，密封編號，4 ℃保存。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：LXJ-IIZ自動脫蓋離心機（上海安亭科學儀器廠）、XSP-00 光學顯微鏡（寧波湛京光學儀器有限公司）、電子秤（上海赫爾普國際貿易有限公司）、玻璃棒、離心管、60 目銅篩和120 目銅篩、酒精燈、自制鐵絲環、載玻片、蓋玻片、密封袋、馬克筆、一次性塑料滴管等。

主要試劑：飽和蔗糖溶液（1 000 g 蔗糖∶640 mL 蒸餾水）、石炭酸品紅染色液、3%鹽酸酒精、2%孔雀綠染液、2.5%重鉻酸鉀溶液（2.5 g重鉻酸鉀∶1 L蒸餾水）。

1.3 試驗方法

1.3.1 隱孢子蟲的收集

采用飽和蔗糖溶液漂浮法，每份被檢糞便樣品取10～50 g，按1∶6 比例加入自來水，攪拌均勻，經60 目和120目銅篩兩遍過濾，3 600 r/min離心5 min，棄去上清液，將沉淀物加入飽和蔗糖溶液（1∶1），攪拌均勻后3 600 r/min離心5 min，卵囊漂浮于上層。吸取表層液于離心管，加入適量的自來水，3 600 r/min 離心5 min，沉淀物即為隱孢子蟲，保存于2.5%重鉻酸鉀溶液。

1.3.2 改良抗酸染色法及蟲種鑒定

因隱孢子蟲卵囊較小，若直接涂片，卵囊檢出率極低，故采用改良抗酸染色法進行卵囊染色。蘸取上層液移于載玻片上，加石炭酸復紅染液2～3滴進行首次染色，緩慢加熱約5 min，水洗；以3%鹽酸酒精脫色1～3 min，水洗；2%孔雀綠復染液染色約1 min，蒸餾水洗滌后以吸水紙吸干，1 000倍油鏡下觀察卵囊。測量100個卵囊的長寬徑值，結合形態特征鑒定蟲種。

2 結果與分析

2.1 邯鄲地區不同地點犢牛隱孢子蟲的感染率（見表1）

由表1 可知，邯鄲地區不同地點犢牛隱孢子蟲病的平均感染率為5.75%（23/400）。由于縣（區）牛場環境和地理位置存在一定差別，犢牛隱孢子蟲病感染率有所不同；其中邯山區隱孢子蟲病感染率最低，為1.25%（1/80）；成安縣和肥鄉區隱孢子蟲病感染率稍高，成安縣感染率為7.50%（6/80），肥鄉區感染率為10.00%（8/80）。

表1 邯鄲地區不同地點犢牛隱孢子蟲的感染率Tab.1 Cryptospridium infection rate of calves in different regions of Handan

2.2 邯鄲地區不同月齡犢牛隱孢子蟲的感染情況（見表2）

由表2 可知，不同月齡犢牛隱孢子蟲的感染率具有差異，其中0～3 月齡犢牛隱孢子蟲感染率較高，為6.67%（16/240）；4～6 月齡犢牛隱孢子蟲感染率較低，為4.38%（7/160）。

表2 不同月齡犢牛隱孢子蟲的感染率Tab.2 Cryptospridium infection rate of calves in different months

2.3 犢牛隱孢子蟲的形態鑒定（見圖1）

由圖1 可知，經飽和蔗糖溶液漂浮的卵囊均呈淡玫瑰紅色，卵囊外圍環繞淡綠色的光圈，卵囊形狀為圓形或卵圓形，卵囊壁較薄，無微孔和極粒，光滑無色。經改良抗酸染色后卵囊呈深玫瑰紅色，殘體背景為綠色，非特異性顆粒為藍黑色，大部分卵囊內子孢子為結構模糊的環狀結構，卵囊平均大小5.0 μm×4.5 μm。本調查結果與文獻報道的感染月齡及形態大小相似，可初步鑒定為調查采集樣本中檢出蟲種微小隱孢子蟲。

圖1 犢牛糞便中的微小隱孢子蟲Fig.1 Cryptosporidium parvum in calf feces

3 討論

隱孢子蟲是一種主要寄生于哺乳動物胃腸道上皮細胞刷狀緣的寄生原蟲，具有廣泛的宿主范圍，可感染包括人在內的240多種動物，可通過水源、食物、空氣等多種途徑傳播。隱孢子蟲主要引起幼齡動物的消化道和呼吸道疾病，可降低其生產性能，嚴重可導致死亡。隱孢子蟲病是重要的人畜共患寄生蟲病之一，是僅次于輪狀病毒的第二大腹瀉病原[11]，已被列為世界最常見的6 種腹瀉疾病之一，并被世界衛生組織和美國疾病預防控制中心列入新發傳染病。2003年，該病也被我國列為重點防范的兩個重要新發寄生蟲病之一。

Cui等[12]研究發現，寧夏某奶牛場大量犢牛發生腹瀉，病死率高達10%以上，其中2～3周齡犢牛的隱孢子蟲感染率高達83.3%。本研究對邯鄲地區犢牛隱孢子蟲的感染情況進行了調查，從感染率和蟲種鑒定方面進行分析，對邯鄲地區隱孢子蟲病防控工作具有重要意義。本試驗調查的400份犢牛糞便樣品中，23份糞便樣品的隱孢子蟲檢驗結果為陽性，陽性率為5.75%（23/400）。任冠靜等[13]對陜西斷奶后犢牛的一項調查發現，隱孢子蟲總感染率為16.8%（19/113），其調查結果與本調查結果差異較大，原因可能是地區與樣本數量存在差異。

本試驗中，邯鄲地區的5個縣（區）調查結果均存在差異，表明不同地區犢牛隱孢子蟲的感染率不同，可能與地理位置和飼養管理及衛生條件等存在密切聯系。調查中，0～3 月齡和4～6 月齡犢牛隱孢子蟲感染感染率差異明顯，0～3月齡感染率較高，陽性率為6.67%。Garber等[14]研究發現，1～3 周齡新生犢牛隱孢子蟲總體感染率較高，為48.0%。Fayer 等[15]研究發現，犢牛隱孢子的感染率為20.5%。Wegayehu 等[16]研究指出，在不同的國家和地區，牛微小隱孢子蟲的流行情況與牛的品種、年齡和地理位置等有關。

早期針對隱孢子蟲的鑒別診斷主要通過顯微鏡觀察，寄生于牛的隱孢子蟲感染種類未能進行準確地鑒定；隨著分子生物學技術的發展，目前檢測隱孢子蟲感染的方法包括病原形態學、分子生物學和免疫學等。病原形態學主要為染色法、漂浮法和沉淀法；分子生物學方法主要有普通PCR、巢式PCR、反轉錄PCR（RT-PCR）、實時熒光定量PCR（real-time PCR）、PCR-限制性片段多態性分析（PCRRFLP）、環介導等溫擴增（LAMP）等檢測技術，是所有檢測方法中最迅速、最敏感、最方便的檢測方法之一；免疫學方法主要有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光法、單克隆抗體技術以及流式細胞術等方法。我國最常用的檢測方法是漂浮法和PCR方法，通過分子生物學手段可以進行隱孢子蟲蟲種鑒定、基因分型、溯源研究及人畜共患病風險評估。牛作為隱孢子蟲的主要感染宿主，奶牛犢牛主要通過糞便以及糞便污染的飲水、飼料感染隱孢子蟲，犢牛住進未經過徹底清洗消毒的犢牛舍常導致新生犢牛大量發病。有研究顯示，過濾式軟體動物已被認為是隱孢子蟲病的潛在來源，但迄今為止尚無公認的暴發記錄[17]。隨著我國牛進口數量急劇增加，牛隱孢子蟲病現在已經成為當前嚴重危害我國養殖業的傳染病之一，應引起高度重視，降低隱孢子蟲病造成的經濟損失。

4 結論

關于犢牛隱孢子蟲病報道較多，但尚未研制出具有顯著臨床療效的藥物或疫苗。本試驗通過調查邯鄲地區犢牛隱孢子蟲的感染情況，為控制隱孢子蟲病的傳播提供參考，為邯鄲地區犢牛隱孢子蟲病的防控與治療提供了依據，對邯鄲地區畜禽的健康具有重要的公共衛生學意義。