猴頭菇多糖聯合順鉑抗肺腺癌的作用研究

陳偉華 李超 林德輝 譚煥民

【摘要】目的：探討猴頭菇多糖（HEP）聯合順鉑（DDP）抑制肺腺癌的作用。方法：采用 MTT 法檢測不同濃度 HEP 分別作用肺腺癌細胞株48 h、72 h 的細胞抑制率，不同濃度 DDP 作用肺腺癌細胞株48 h 的細胞抑制率，及 HEP 聯合 DDP 作用肺腺癌細胞株48 h 的細胞抑制率。設對照組、HEP 組、DDP 組和聯合組，觀察 HEP 聯合 DDP 對移植瘤的作用，采用 ELISA 法檢測各組裸鼠血清中 IL-2水平。結果： HEP 對肺腺癌細胞具有一定的抑制作用，且具有時間和濃度依賴性。 DDP 能顯著抑制肺腺癌細胞。HEP 可以促進 DDP 對于肺腺癌細胞和裸鼠移植瘤的抑制作用，可減輕 DDP 對裸鼠體重的影響。HEP 組和聯合組小鼠血清中 IL-2水平顯著高于 DDP 組。結論：猴頭菇多糖可有效增強順鉑的抗肺腺癌作用，并減輕其不良反應。

【關鍵詞】猴頭菇多糖;肺腺癌;順鉑;IL-2

[中圖分類號]R285.5[文獻標識碼]A[文章編號]2096-5249（2022）01-0012-04

Effect ofHericiumerinaceus polysaccharide combined with cisplatin on lung adenocarcinoma

CHEN Wei-hua*， LI Chao， LIN De-hui， TAN Huan-min （Department of oncology，Anhua County Peoples Hospital， Yiyang Hunan413500， China）

[Abstract] Objective： To study the effect of Hericiumerinaceus polysaccharide combined with cisplatin on lung adenocarcinoma. Methods： MTT assay was used to detect the cell inhibition rates of the lung adenocarcinoma cell lines treated with HEP for 48 h and 72 h， DDP for 48 h， and HEP combined with DDP for 48 h. The effect of HEP combined with DDP on transplanted tumor was observed in the control group， the HEP group， the DDP group and the combined group. The serum levels of IL-2 in four groups were detected by ELISA. Results： HEP could inhibit the lung adenocarcinoma cells in a time and concentration-dependent manner. DDP could significantly inhibit the lung adenocarcinoma cells. HEP could promote the inhibitory effect of DDP on the lung adenocarcinoma cells and the transplanted tumors of the nude mice. Moreover， it could reduce the weight loss of nude mice in the DDP group. The serum levels of IL-2 in the HEP group and the combined group were significantly higher than that in DDP group. Conclusion： Hericiumerinaceus polysaccharide might effectively enhance the anti-tumor effect of cisplatin on lung adenocarcinoma.

[Key words] Hericiumerinaceus polysaccharide; Lung adenocarcinoma; Cisplatin; IL-2

猴頭菇，又名猴頭菌，性甘、平，是一種藥食兼用的真菌，其營養價值豐富。研究結果顯示，猴頭菇作用廣泛，其具有良好的抗氧化活性，可增強細胞的抗疲勞和抗衰老能力[1]，能增強免疫力[2]。猴頭菇多糖（Hericiumerinaceus polysaccharide， HEP）是猴頭菇中一種重要的活性成分，可以開發成免疫佐劑 [3]，抗潰瘍性結腸炎[4]。值得一提的是，猴頭菇多糖還有一定的抑制肺癌等腫瘤的作用[5-6]。目前肺癌的發病率和死亡率在惡性腫瘤中均位列第一，其中最常見的類型為肺腺癌。根據2021版肺癌 NCCN 指南，針對不同基因突變，不斷有新的靶向藥物被批準應用于臨床。但是對于沒有基因突變的晚期肺腺癌患者，標準治療仍然為以鉑類為基礎的聯合化療 [7]。因此本研究將從體外和體內層面探討 HEP 與順鉑 DDP 在肺腺癌治療中是否具有協同作用，為臨床治療提供新思路。

1 材料

HEP 委托湖南省中醫藥大學提純制備，質量分數 75.22%，使用前用細胞培養液配置，DDP（Sigma- Aldrich 公司）;人肺上皮細胞 BEAS -2B、肺腺癌細胞株株 A549、H1299均購自中南大學高等研究中心;BEGM Kit 培養液（美國 Lonza 公司），RMPI- 1640細胞培養基和胎牛血清（FBS）（美國 Gibco 公司）;5周齡 BALB/c 雌性裸鼠（18±2）g，購自上海斯泰克實驗動物有限責任公司。

2 方法

2.1細胞培養 BEAS -2B 用BEGMKit培養液， A549、H1299細胞用含有10% FBS 的 RMPI-1640培養基培養，置于5% CO2，37℃，飽和濕度細胞培養箱內。

2.2腫瘤細胞增殖實驗肺腺癌細胞培養至對數生長期，用胰酶消化，細胞計數后用細胞培養液調整細胞濃度為1×105個 /mL。取96孔板，每孔接種100 μL細胞懸液，孵育24 h 后，更換培養液為100μL 含有不同濃度測試藥物的新鮮培養液。每個濃度設置3個復孔，同時設置純培養液為空白組，不加藥物的細胞懸液為對照組。將96孔板置于 CO2培養箱孵育48 h 或72 h 后，每孔加入10 μL新鮮配置的噻唑藍（MTT）溶液，孵育3～4 h。棄去培養液，每孔加入100μL 的 DMSO，用酶標儀檢測492 nm 處的吸收值（A）。計算腫瘤細胞增殖的抑制率 I（%），抑制率=[1-（A藥物-A空白）/（A 對照-A空白）]×100%。

2.3異種移植瘤裸鼠體內實驗 A549細胞長至對數生長期，及時用胰酶消化，分別用 PBS 液洗滌 2次，不含血清的 RMPI-1640洗滌1次。再用不含血清的培基配成1×107個 /mL 的細胞懸液，每只注射100μL 于背部皮下。模型裸鼠隨機分組，分別腹腔注等量空白溶劑（對照組，n=6），猴頭菇多糖200 mL/kg（HEP 組，n=6），順鉑2 mg/kg（DDP 組，n=6）， HEP 200 mL/kg+DDP 2 mg/kg（聯合組，n=6）。HEP 和DDP 均為隔日給藥，連續給藥21d，結束實驗。

2.3.1檢測抑瘤率分別在給藥前、給藥14 d、21 d 記錄裸鼠體重。給藥前、給藥2周用游標卡尺測量瘤體的長徑、短徑，根據體積（mm3）=長徑×短徑2 /2計算腫瘤體積，根據抑瘤率=（對照組平均體積-藥物組平均體積）/對照組平均體積×100%計算抑瘤率。

2.3.2白細胞介素（interleukin，IL）IL-2的檢測給藥21 d 后麻醉處死裸鼠，摘除眼球取血，提取血清。采用 ELISA 法檢測各組裸鼠血清中 IL-2含量。

2.4統計學方法使用 SPSS 25.0進行統計分析，所得結果用x ±s 表示，多組間數據比較使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1猴頭菇多糖對肺腺癌細胞株的抑制作用MTT 法常用來檢測不同物質抑制細胞活力的作用強度。我們選用常見的人肺上皮細胞 BEAS-2B、肺腺癌細胞 A549、H1299細胞株，采用 MTT 法檢測0、4、8、16、32 μg/mL HEP 分別作用48 h、72 h 對細胞活力的影響。如圖1所示，HEP 對人肺上皮細胞BEAS-2B 基本無影響，但是對肺腺癌細胞具有一定的抑制作用，且具有時間和濃度依賴性。兩種肺腺癌細胞株的抑制率無明顯差異，但是在不同時間點， A549細胞的抑制率均大于 H1299細胞。

3.2DDP 對肺腺癌細胞株的抑制作用如圖2所示，分別用為0、2、4、8、16、32 μM的 DDP 處理不同肺腺癌細胞48 h 后，其細胞增殖受到抑制。且隨著 DDP 濃度升高，A549細胞和 H1299細胞的抑制率均逐漸升高，呈現出明顯的劑量依賴性。通過計算，DDP 對 A549細胞和 H1299細胞的 IC50分別為5.19μM 和5.66μM。

3.3 HEP 聯合 DDP 對肺腺癌細胞株的抑制作用根據3.1、3.2的結果，HEP 和 DDP 對于 A549細胞株的抑制作用強于 H1299細胞株，因此我們選用 A549細胞株做后續實驗。我們分別選用0、8、16μg/mL 的 HEP 分別聯合0、4、8 μM的 DDP 作用肺腺癌，用 MTT 法檢測48 h 對細胞的抑制率。如表2所示，猴頭菇可以促進 DDP 對于肺腺癌細胞株的抑制作用，顯著高于相應濃度單藥組（P<0.05）。

3.4 HEP 與 DDP 聯用對荷瘤裸鼠的作用根據預實驗結果，我們選擇 HEP 和 DDP 的實驗濃度分別為100 mg/kg、1 mg/kg。與對照組相比，14 d 開始DDP 對裸鼠體重有影響（P<0.05），但是 HEP 單獨應用與 DDP 聯合應用對裸鼠體重無明顯影響（P>0.05），詳見表3。藥物干預前對照組，DDP 組、HEP 組和聯合組的裸鼠腫瘤體積無統計學差異（P>0.05）。治療14 d 開始，與對照組相比，DDP 組、聯合組移植瘤體積開始逐漸顯著減小（P<0.05），第21 d HEP 組移植瘤體積顯著減小，聯合組與 DDP 組間差異顯著，詳見表4。

3.5不同組別裸鼠血清 IL-2含量變化與對照組比較，HEP 組和聯合組小鼠血清中 IL -2水平比 DDP 組高，差異具有統計學意義（P<0.05），詳見表5。

4 討論

研究表明許多傳統植物中包含有效成分，提取的多糖作用非常廣泛：黃芪多糖有助于減少缺血再灌注人心臟微血管內皮細胞凋亡，減輕氧化損傷，抑制炎癥介質分泌[8];紅毛五加多糖可顯著激活小鼠巨噬細胞[9];白毛藤多糖和地參多糖具有抗腫瘤作用[10-11]。既往研究發現從猴頭菇中提取的多糖在腫瘤中具有一定的作用，可作為一種免疫佐劑促進腫瘤疫苗的作用[12]，對 Lewis 肺癌也有一定的抑制作用。我們的實驗結果表明隨著猴頭菇多糖濃度的增加，其對于正常的支氣管上皮無影響，但對肺腺癌的抑制作用逐漸加強。

順鉑等鉑類藥物抗癌譜廣、作用性強。由于鉑類藥物為強蓄積性藥物，在治療惡性腫瘤有較大的毒性，容易產生腎毒性、消化道反應以及骨髓抑制等副作用[13]。我們發現：與單用猴頭菇多糖、順鉑相比，猴頭菇多糖可增強順鉑的抗腫瘤作用，且可以減輕順鉑對裸鼠體重的影響，說明猴頭菇多糖可能在一定程度上還能減輕順鉑的不良反應。

IL-2是第一個被分子克隆的細胞因子，許多實驗表明 IL-2是 T 細胞增殖、生成效應細胞和記憶細胞所必需的 T 細胞生長因子，能促進 Treg 細胞的生成、存活和功能活動，因此具有雙重和相反的功能，維持 Treg 細胞以控制免疫應答和刺激常規 T 細胞以促進免疫應答[14]。IL -2還可以刺激 NK 細胞活化、分化和增殖，且與其他細胞因子協同作用，放大免疫效應。本實驗結果顯示猴頭菇多糖可明顯提高聯合組裸鼠血清中 IL-2水平，提示猴頭菇多糖可能通過提高 IL-2水平來促進順鉑的抗腫瘤作用，但是其具體機制還有待進一步探究。

猴頭菇多糖由猴頭菇中提取，后者是一類常見易獲得的藥食兼備的食物。我們的研究結果說明猴頭菇多糖可協同順鉑明顯抑制肺腺癌的生長，其遠期應用前景值得期待。我們將通過細胞實驗和已成功構建的裸鼠成瘤模型，深入探討其具體作用通路和分子機制，為肺腺癌臨床治療提供新的有效方案。

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基金項目：湖南省自然科學基金項目資助（編號：2018LL2002）

作者簡介：陳偉華（1977-），女，湖南益陽人，學士，湖南省安化縣人民醫院腫瘤科。

通信作者：陳偉華，E-mail：2625809700@qq.com。

（收稿日期：2021-12-7 接受日期：2021-12-17）