玫瑰花復合煎劑的毒性及免疫活性研究

鄭小娟

[摘要]目的：玫瑰花復合煎劑的急性毒性反應及對小鼠免疫活性的研究。方法：采用最大耐受劑量法，以15000.mg/（kg·BW）劑量玫瑰花復合煎劑給予小鼠灌胃，觀察動物在一周內的活動及中毒情況，考察小鼠是否有死亡現象，并進行大體解剖觀察病理改變;在加S9與不加S9混合液的條件下進行Ames試驗，以2.5、5.0、.10.0.g/（kg·BW）玫瑰花復合煎劑灌胃小鼠，進行小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗。保健功能試驗：以300、600、1200.mg/（kg·BW）劑量組連續灌胃小鼠30天，另設玫瑰花組和蒸餾水陰性對照組，測定臟器/體重比值，小鼠的遲發型變態反應（耳腫脹法），小鼠抗體生成細胞數（Jerne改良玻片法）以及NK細胞活性（乳酸脫氫酶測定法），以考察其增強免疫力的作用。結果：急性經口毒性實驗中，小鼠一般表現和行為均未見異常且無死亡;三項遺傳試驗結果均為陰性，未見遺傳毒性;增強免疫力實驗中，與陰性對照組相比，玫瑰花復合煎劑300、600、1200.mg/（kg·BW）各劑量組的小鼠左右耳片重量差值、溶血空斑數有顯著性差異（P<0.05）;600、.1200.mg/（kg·BW）劑量組小鼠NK細胞活性均有顯著性差異（P<0.05）;玫瑰花組小鼠左右耳片重量差值、溶血空斑數與陰性對照組相比均有顯著性差異（P<0.05）。結論：玫瑰花復合煎劑無明顯的急性毒性反應，屬無毒級，且無遺傳毒性;玫瑰花與黃精組成配伍聯合應用其增強免疫功能較玫瑰花單方更加顯著。

[關鍵詞]玫瑰花;黃精;急性毒性;遺傳毒性;免疫

[中圖分類號]R392.11.

[文獻標識碼]A.

[文章編號]2096-5249（2022）03-0184-03

玫瑰花是薔薇科植物玫瑰的干燥花蕾[1]，《本草綱目拾遺》載：“玫瑰花活血、行血、健脾降火、理氣調經、滋補養顏”。傳統中醫認為，玫瑰花甘、微苦，具有行氣解郁、止痛和血及活血散瘀等功效，常用于肝胃氣痛、月經不調，跌撲傷痛等，常被用來當作茶飲。

黃精為百合科黃精屬（Liliaceae）的干燥根莖，主要包括滇黃精Polygonatum kingianum Coll.Et Hemsl、黃精Polygonatum sibiricum Red或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua[2]。主要化學成分有多糖、皂苷、蒽醌等[3]。藥典記載，黃精性平、味甘，具有補氣養陰、益腎健脾的功效。李時珍引《神仙草芝經》云：“黃精寬中益氣，使五臟調和，肌肉充盈，骨髓堅強，其力倍增，多年不老，顏色明顯，發白更黑，齒落更生”。我國傳統醫學認為，黃精可長期用于治療脾胃虛弱、精血不足、腎虛虧損、倦乏無力等，自古以來就被認為是補益類中藥中的上品[4]。

玫瑰花在免疫方面的試驗研究較少，本研究主要探討以玫瑰花及玫瑰花配伍黃精后對小鼠免疫指標的影響，同時對其毒理學試驗進行評價，為臨床應用提供一定的實驗基礎。

1材料與對象

1.1實驗動物

昆明種小鼠420只，選用蘇州大學昭衍新藥研究中心培育的SPF級小鼠（合格證編號201900963）。雌雄各半，體重18～22g。

1.2受試物與試劑

玫瑰花組：取玫瑰花300g，加入12倍量水提取2次，每次2h，濾過，合并2次提取液減壓濃縮至1g/mL。

玫瑰花復合煎劑：取玫瑰花、黃精各300g分別加入12倍量水提取2次，每次2h，濾過，合并2次提取液減壓濃縮至1g/mL。實驗時用蒸餾水配制，冷藏保存。

1.3主要儀器和試劑

100μL微量注射器、電子分析天平、手術器械、723分光光度儀、RPMI1640玻片架、顯微鏡、離心機、二氧化碳培養箱、SRBC、Hank’s液、DNFB、丙酮、乳酸脫氫酶、恒溫水浴等。

1.4實驗方法

急性經口毒性實驗：采用最大耐受劑量法，設玫瑰花復合煎劑15000mg（/kg·BW）一個劑量組，小鼠20只，雌雄各半，隨機分為給藥組和對照組，均按20mL（/kg·BW）經口灌胃。灌胃前動物禁食12h，不限飲水。對照組灌胃等體積的生理鹽水，期間試驗小鼠正常飲食和飲水。連續觀察一周，觀察外表體征、精神狀態等，每天記錄小鼠的體重、飲水量、進食量的變化以及動物的中毒表現以及是否有死亡現象發生，實驗結束后處死動物做大體解剖[5]。

遺傳毒性試驗：（1）Ames試驗。將受試物高壓滅菌后置于4°C冰箱保存，試驗前用無菌去離子水等比例進行稀釋，設立濃度為8、40、200、1000、5000μg/皿5個劑量組，采用平板摻入法，在加與不加體外活化系統（S9混合液）的條件下進行。試驗同時設立溶劑對照組、未處理對照組（自發回變組）和陽性對照組。若受試物的回變菌落數高于自發回變菌落數的2倍以上，且具有一定的劑量反應關系，則表明細菌回復突變試驗結果為陽性，整個試驗在相同的條件下重復進行一次。（2）小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗。小鼠雌雄各半，隨機分成5組（n=10），即2.5、5.0、10.0g（/kg·BW）劑量組，陽性對照組注射環磷酰胺40mg/kg，陰性對照組灌服等體積蒸餾水。給藥2次，間隔24h，第2次給藥后6h，將動物處死，制骨髓涂片、晾干、甲醇固定、Giemsa染色。鏡檢PCE，計算微核率。（3）小鼠精子畸形試驗。雄性小鼠隨機分成5組（n=10），即2.5、5.0、10.0g（/kg·BW）劑量組，陰性對照組和環磷酰胺陽性對照組（40mg/kg）。按20mL（/kg·BW）容量灌胃5d，繼續喂養1個月，35d后處死，取出其兩側睪丸、附睪，放入生理鹽水離心管中，制成精子懸液，過濾、濾液涂片，用體積分數1%的伊紅染色，晾干，油鏡下檢查精子形態，記錄畸形精子數，計算精子畸形率。

1.5增強免疫力實驗

劑量選擇：玫瑰花復合煎劑設300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組，另設玫瑰花組和蒸餾水陰性對照組。各組小鼠每日灌胃量均為0.2mL/10（g·BW），連續灌胃30d。

脾臟/體重比值、胸腺/體重比值：試驗結束時稱量動物體重，于處死動物后，取出脾臟和胸腺，并進行稱重，計算脾臟/體重比值、胸腺/體重比值。

二硝基氟苯誘導小鼠DTH試驗（耳腫脹法）：在小鼠右耳兩面均勻涂抹DNFB溶液，以此進行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，按要求進行稱重。用左右耳重量之差表示DTH的程度。方法參照《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）試驗方法進行[7]。

抗體生成試驗（Jerne改良玻片法）：脫纖維綿羊紅細胞免疫5d處死動物，取脾臟制成脾細胞懸液，將表層培養基加熱溶解后，放45～50°C水浴保溫，與等量中性2倍的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，向管內加入50μL10%SRBC，25μL脾細胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待凝固后，放入二氧化碳培養箱1.5h，用SA緩沖液稀釋的補體

（1∶8）加入到片架凹槽內，繼續溫育1.5h，計數溶血空斑數。

NK細胞活性測定（乳酸脫氫酶LDH測定法）：頸椎脫臼處死小鼠，制備濃度為2×107個/mL的脾細胞懸液。將脾細胞和靶細胞YAC-1細胞各100μL分置于96孔培養板中，參考保健食品檢驗與評價技術規范（2003年版）操作，在490nm處測定OD值，計算NK細胞活性率。

1.6統計學分析

所有數據采用SPSS21.0軟件進行處理。計量資—料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1急性經口毒性實驗

給予玫瑰花復合煎劑后，小鼠一般表現和行為均未見異常，觀察期內未見動物死亡，灌胃最大給藥劑量連續觀察7d小鼠外觀、精神等均無異常。對照組和給藥組平日進食量和飲水量無顯著差異，未出現毒性反應。實驗結束時處死動物，大體解剖肉眼觀察未見病理異常改變。說明玫瑰花復合煎劑對小鼠急性經口MTD值均大于15000mg（/kg·BW），按急性毒性分級，該受試物屬于無毒級。

2.2遺傳毒性試驗結果

對TA97、TA98、TA100和TA102試驗菌株，不同濃度受試物在加和不加S9條件下的回變菌落數與陰性對照組無顯著差異（P>0.05），而陽性對照組回變菌落數均高于陰性對照組回變菌落數2倍以上（P<0.05）。玫瑰花復合煎劑細菌回復突變試驗檢測結果為陰性，重復試驗仍得出相同結果。

與陰性對照組比較，玫瑰花復合煎劑各劑量組微核率無顯著性差異（P>0.05）;與陰性對照組比較，環磷酰胺陽性對照組微核率有顯著性差異（P<0.01）。

與陰性對照組比較，玫瑰花復合煎劑各劑量組小鼠精子畸形率無顯著性差異（P>0.05）;與陰性對照組比較，環磷酰胺陽性對照組小鼠精子畸形率有顯著性差異（P<0.01）。

2.3免疫功能試驗結果

連續灌胃30d后，玫瑰花組、玫瑰花復合煎劑300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組動物的脾臟/體重比值、胸腺/體重比值與陰性對照組相比，均無顯著性差異（P>0.05），見表1。

連續灌胃30d后，與陰性對照組相比，玫瑰花復合煎劑三個劑量組動物的左右耳片重量差值，300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組動物均有顯著性差異（P<0.05）。玫瑰花片組左右耳片重量差值也明顯增加（P<0.05），見表2。

連續灌胃30d后，玫瑰花復合煎劑三個劑量組動物的溶血空斑數與陰性對照組相比，300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組動物均有顯著性差異（P<0.05）。玫瑰花片組溶血空斑數也明顯增加（P<0.05），見表3。

連續灌胃30d后，玫瑰花復合煎劑三個劑量組、玫瑰花組動物的NK細胞活性與陰性對照組相比均有不同程度的增加，玫瑰花復合煎劑600、1200mg（/kg·BW）劑量組有顯著性差異（P<0.05），見表4。

3結論

免疫是機體識別和排除抗原性異物，維護自身生理平衡和穩定的一種功能。人體的免疫系統由免疫器官（如胸腺、脾臟等）、免疫細胞（如吞噬細胞、淋巴細胞等）和免疫分子（如補體、細胞因子等）所組成，通過先天性免疫（非特異性免疫）和獲得性免疫（特異性免疫）來執行，發揮免疫防御、免疫穩定和免疫監視三大功能。

玫瑰花含有黃酮類、多酚、多糖等多種化學成份，具有免疫調節、抗氧化、抗癌抗菌、降血脂和預防心臟病等生理活性[8]。黃精在臨床中是重要的扶正固本類中藥，常被用于補益脾腎、填精補腎，增強機體免疫的功效。黃精多糖作為黃精中主要的有效成分，具有多種生物活性[9-10]，沈建利等[11]以黃精多糖（100、400、800mg/kg）灌胃環磷酰胺誘導的免疫抑制模型小鼠，免疫抑制小鼠的臟器指數、血清溶血素水平及吞噬指數顯著提高（P<0.05）;表明黃精多糖可增強機體免疫力。葉紹凡[12]的研究顯示，給予黃精多糖，可顯著提高運動小鼠胸腺指數、脾臟指數、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、巨噬細胞吞噬率、吞噬指數，與單純運動組相比差異具有統計學意義，且作用呈現劑量相關性。提示黃精多糖可提高長期力竭訓練小鼠的免疫能力，具有顯著免疫增強效應。

本研究實驗結果表明玫瑰花、黃精復合煎劑連續灌胃小鼠30d后，能顯著提高小鼠的遲發變態反應、溶血空斑數以及NK細胞活性。可初步判定，玫瑰花及黃精配伍可增強動物細胞免疫、體液免疫和NK細胞活性，具有增強免疫力的功能，且功效較玫瑰花單用更加顯著。本實驗毒理結果表明，玫瑰花與黃精復合煎劑對小鼠急性經口毒性試驗結果MTD值>15000mg（/kg·BW），屬無毒級，小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、Ames試驗均未見遺傳毒性，為用藥劑量及安全性提供了參考。