不同劑量血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊負荷及CXCL16和MMP-1表達水平的影響

陳靜文 裴菱花 竇麗萍 王審 楊明 黃抒偉

[摘要] 目的 探討血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊負荷及炎癥因子CXCL16、MMP-1表達的影響。方法 APOE基因敲除小鼠高脂飼料喂養8周后，油紅O染色證實造模成功。將30只小鼠隨機分為血府逐瘀湯高劑量組、低劑量組、對照組。4周后對每組主動脈根部切片的斑塊面積進行測定，檢測主動脈組織中CXCL16、MMP-1蛋白及mRNA的表達水平。結果 三組小鼠主動脈根部AS斑塊平均面積為（0.047±0.019）、（0.073±0.018）、（0.079±0.011）mm2，高劑量組斑塊面積小于低劑量組（P<0.05），低劑量組斑塊面積小于對照組（P>0.05）。三組CXCL16蛋白的相對水平分別為（0.422±0.065）、（0.640±0.070）、（0.849±0.054），差異均有統計學意義（P<0.001）。MMP-1蛋白的相對水平分別為（0.260±0.031）、（0.535±0.050）、（0.736±0.039），差異均有統計學意義（P<0.001）。CXCL16 mRNA相對表達水平分別為（0.407±0.023）、（0.725±0.044）、（0.823±0.038），差異均有統計學意義（P<0.001）。MMP-1 mRNA相對表達水平分別為（0.392±0.034）、（0.513±0.033）、（0.668±0.046），差異均有統計學意義（P<0.001）。結論 血府逐瘀湯抑制AS小鼠主動脈斑塊CXCL16、MMP-1的表達，高劑量干預下可降低斑塊負荷。

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化;血府逐瘀湯;CXCL16;MMP-1;小鼠

[中圖分類號] R543.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）06-0024-04

[Abstract] Objective To explore the effects of Xuefu Zhuyu Decoction on aortic plaque burden and expression levels of inflammatory factors CXCL16 and MMP-1 in atherosclerotic mice. Methods Successful modeling was confirmed by oil-red O staining after 8 weeks of high-fat chow feeding in APOE-knockout mice. Thirty mice were randomly divided into the Xuefu Zhuyu Decoction high-dose intervention group， the low-dose intervention group and the control group. The plaque area of aortic root sections in each group was measured 4 weeks later， and the expression levels of CXCL16 and MMP-1 protein and mRNA in aortic tissues were detected. Results The mean areas of atherosclerosis （AS） plaque in aortic root? of mice in the three groups were （0.047±0.019）， （0.073±0.018）， and （0.079±0.011）mm2， and the plaque area in the high-dose group was smaller than that in the low-dose group （P<0.05）， and the plaque area in the low-dose group was smaller than that in the control group （P>0.05）. The relative levels of CXCL16 protein in the three groups were （0.422±0.065）， （0.640±0.070）， and （0.849± 0.054）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative levels of MMP-1 protein were（0.260±0.031）， （0.535±0.050）， and （0.736±0.039）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative expression levels of CXCL16 mRNA were （0.407±0.023）， （0.725±0.044），（0.823±0.038）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative expression levels of MMP-1 mRNA were （0.392±0.034）， （0.513±0.033）， （0.668±0.046）， with statistically significant difference （P<0.001）. Conclusion Xuefu Zhuyu Decoction can inhibit the expressions of CXCL16 and MMP-1 in aortic plaques of AS mice， and reduce plaque burden with high-dose intervention.

[Key words] Atherosclerosis; Xuefu Zhuyu Decoction; CXCL16; MMP-1; Mice

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種進展緩慢的心血管系統疾病。CXC型趨化因子配體16（CXC-chemokine ligand 16，CXCL16）作為清道夫受體吞噬ox-LDL，促進內皮泡沫細胞形成[1]，高表達于粥樣斑塊中[2]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族成員MMP-1能降解粥樣硬化斑塊纖維帽中的Ⅰ、Ⅲ型膠原，使纖維帽變薄易破裂[3]。Macarie等[4]研究發現，MMP-1的過度表達及活化與AS斑塊的不穩定性密切相關。MMP-1水平有助于評價斑塊破裂的風險[5]。血府逐瘀湯由清代醫家王清任在《醫林改錯》中提出[6]，本方主活血化瘀、宣痹通絡，是中醫治療“胸痹”的經典方[7]，其與他汀類藥物合用，可進一步減少頸動脈內膜厚度、減小斑塊面積[8]，但血府逐瘀湯對CXCL16、MMP-1的影響尚不明確。

1 材料與方法

1.1 材料來源

①8周齡SPF級雄性APOE-/-小鼠40只，體重（20±2）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物公司，許可證號為SCXK（滬）2018-0006。血府逐瘀湯制備藥材購自浙江中醫藥大學附屬第二醫院。②主要試劑：Western-blot試劑盒（美國Invitrogen公司）;逆轉錄試劑盒（Fermentas公司）;③CXCL16、MMP-1引物及內參由上海生工公司設計。

1.2 方法

1.2.1 AS小鼠造模及分組? 參照文獻[9]選擇APOE-/-小鼠，經高脂飼養8周后，取主動脈根部組織脫水、包埋、切片，油紅O染色12～15 h后，如光鏡下見脂質斑塊，表示AS建模成功。將30只小鼠隨機分為血府逐瘀湯高劑量組、低劑量組、對照組，每組各10只。

1.2.2 血府逐瘀湯制備及給藥? 桃仁12 g，紅花9 g，當歸9 g，生地9 g，川芎4.5 g，赤芍6 g，牛膝9 g，桔梗4.5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草3 g，加水750 ml，浸泡30 min，煮沸后文火慢煎40 min，濃縮至150 ml，即含藥濃度0.5 g/mL。根據小鼠給藥劑量公式計算給藥量[10]，每日1次，共4周。高劑量組每天給予2 ml/100 g體重灌胃，低劑量組每天給予1 ml/100 g體重灌胃，對照組不給藥。

1.2.3 采集主動脈標本及組織病理觀察? 12周末采集主動脈標本。將心臟-主動脈整條分離，從主動脈根部以上2 mm處斷開，標本均保存固定。主動脈根部組織進行脫水、石蠟包埋，切片時參考Suzuki[11]確立的方法，顯微鏡下見到主動脈瓣三瓣中任何一瓣的根部出現后連續切片，厚度為5 μm。油紅O染色后光鏡下可見紅色深染脂質斑塊（圖1），Image J軟件定量測定斑塊面積。

1.2.4 CXCL16、MMP-1蛋白水平測定（Western-blot）? ?將主動脈組織研磨混合，每組提取1 mg， 加入裂解液處理30 min， 收集后提取上清并煮沸。上樣后電泳分離、轉膜、封閉，分別加入CXCL16和MMP-1的一抗，4℃冰箱避光孵育（>12 h） 。次日孵育二抗后顯影成像。Image J軟件分析條帶測定灰度值。

1.2.5 CXCL16、MMP-1mRNA水平測定（RT-PCR）? 提取主動脈組織總RNA。CXCL16上游引物5-ACTC- AGCCAGGCAATGGCAAC-3′;下游引物5′-GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC-3′;長度693 bp。MMP-1上游引物5′-CCTGAAGAATGATGGGAGGCAAG-3′;下游引物5′-GCTCTTGGCAAATCTGGCGTG-3′，長度255 bp。GAPDH上游引物：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′;下游引物：5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′，長度350 bp。PCR反應條件為：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 3 0 s，72℃ 45 s，擴增33個循環，72℃延伸10 min，電泳30 min。Image J軟件測量條帶灰度值。

1.3統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件處理數據，計量資料均以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠主動脈根部切片油紅染色及斑塊面積情況

三組小鼠主動脈根部切片油紅染色照片見圖1，箭頭所指暗紅色區域為AS斑塊。Image J軟件定量測定結果顯示，高劑量組斑塊平均面積小于低劑量組及對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;低劑量組斑塊平均面積與對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖2。

2.2 三組小鼠主動脈組織CXCL16、MMP-1、β-Actin蛋白水平情況比較

三組小鼠主動脈組織CXCL16、MMP-1、β-Actin蛋白Western-blot條帶照片見封三圖1。高劑量組CXCL16、MMP-1蛋白相對水平低于低劑量組及對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;低劑量組相對水平低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖3。

2.3 三組小鼠主動脈組織CXCL16、MMP-1、內參GAPDH基因表達情況

三組小鼠主動脈組織CXCL16、MMP-1、GAPDH基因RT-PCR電泳照片見封三圖2。高劑量組CXCL16、MMP-1基因相對表達水平低于低劑量組及對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;低劑量組相對表達水平低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖4。

3 討論

炎癥反應在AS發生發展中起著關鍵性作用，貫穿于粥樣硬化斑塊的形成、演變以及破裂的整個病理過程。Kapoor等[12]研究發現，一些穩定性冠心病患者盡管接受了嚴格生活方式指導及最優化的藥物治療，內環境中的炎癥及免疫反應仍然持續存在，導致疾病反復甚至進展。抗AS治療不僅僅是降膽固醇，抗炎治療的重要作用也越來越被重視。COLCOT研究[13]、CANTOS研究[14]均分別觀察秋水仙堿、Canakinumab在急性心肌梗死中的治療作用，均闡明了抗炎治療可降低心肌梗死患者遠期心血管事件發生風險，證實了抗炎治療的有效性。在中醫藥領域，Lin等[15]體外細胞培養內皮細胞發現，血府逐瘀湯可以抑制血管內皮生長因子表達。程茂維[16]觀察82例急性腦梗死患者發現，在常規他汀治療基礎上加用血府逐瘀湯可進一步降低患者膽固醇、三酰甘油水平。楊華等[17]將血府逐瘀湯加減應用于急性冠狀動脈綜合征患者的治療，觀察發現治療后1年內心絞痛及心肌梗死再發率、住院率均明顯下降。C反應蛋白是冠心病獨立的生物標志物[18]，可呈劑量依賴性上調巨噬細胞表達及分泌CXCL16[19]。陳東等[20]報道，C反應蛋白可上調巨噬細胞表達及分泌MMP-1。同時CXCL16、MMP-1高表達于粥樣斑塊中，因而本研究選擇CXCL16、MMP-1作為研究靶點。

本研究結果顯示，APOE基因敲除小鼠經高脂飲食喂養8周后成功造模為AS小鼠，予不同濃度血府逐瘀湯干預喂養4周后，小鼠主動脈組織CXCL16及MMP-1蛋白相對水平降低，CXCL16及MMP-1mRNA相對表達水平降低。該作用在低劑量血府逐瘀湯干預后即可顯現，且干預濃度越高，降低作用越明顯，提示血府逐瘀湯具有抑制CXCL16、MMP-1這兩種炎癥因子的表達作用，從而保護內皮細胞抑制泡沫細胞形成，降低已形成斑塊破裂的風險。通過對三組小鼠主動脈根部切片油紅染色AS斑塊面積定量測定發現，高劑量組血府逐瘀湯干預后小鼠AS斑塊面積較低劑量組、對照組顯著減小，但低劑量組與對照組之間并無顯著差異，表明高劑量血府逐瘀湯干預AS模型后，在一定程度上減少了主動脈斑塊負荷，抑制了AS的進展。

本研究存在一些不足之處，如樣本量較小、研究周期短，且并未涉及具體機制、作用通道的研究。在本研究基礎上可進一步擴大樣本量、延長觀察時間進一步評估中遠期療效，同時可探討血府逐瘀湯抑制CXCL16及MMP-1表達的具體作用途徑，旨在深入闡明血府逐瘀湯抑制AS進展的作用機制。

綜上所述，血府逐瘀湯具有抑制AS小鼠主動脈組織CXCL16及MMP-1的表達作用，在高劑量干預下可降低粥樣硬化血管的斑塊負荷，在一定程度上延緩AS進展，為臨床動脈粥樣硬化性心血管疾病的中醫藥治療提供理論依據。

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（收稿日期：2021-01-18）