基于網絡藥理學探討血府逐瘀湯中川芎-赤芍藥對調節血管新生的分子機制

左春蘭 劉娜婷 蔡曉婷 林凡

[摘要] 目的 分析血府逐瘀湯關鍵藥對川芎-赤芍調節血管新生的物質基礎和作用機制。方法 從TCMSP數據庫及Drug Bank數據庫挖掘川芎-赤芍的成分及其對應靶蛋白，從GeneCards數據庫獲取“血管新生”相關基因;利用Omicshare數據庫中的Venn功能獲取川芎-赤芍干預血管新生的靶點后，借助Cytoscape（3.8.2）軟件構建“活性成分—川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白”網絡關系圖，在String數據庫構建“川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白--人類蛋白”互作網絡，并篩選核心靶點;所得靶點的基因本體論（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析在Omicshare網站進行。借助AutoDock vina軟件對核心靶點和關鍵活性成分進行分子對接。結果 獲得川芎-赤芍活性成分20種，相關靶蛋白117種，川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白72個，其中，關鍵活性成分為黃芩素、鞣花酸、β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅酮、（+）-兒茶素、阿魏酸、川芎嗪等，關鍵靶蛋白為蛋白激酶Bα（AKT1）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、白細胞介素-6（IL-6）、P53腫瘤蛋白（TP53）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環加氧酶2（PTGS2）、熱休克蛋白90αA1（HSP90AA1）、c-fos原癌基因蛋白（FOS）等。GO結果提示，該藥對在細胞增殖、生長、生物粘附、細胞聚集等方面影響血管新生;通路富集結果顯示，AGE-RAGE通路、IL-17通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化信號通路等是藥物作用的主要通路。分子對接提示核心靶點與關鍵化合物具有良好的結合能力。結論 血府逐瘀湯中的川芎-赤芍藥對通過多靶點、多途徑對血管新生起調節作用，為血府逐瘀湯干預血管新生的進一步研究及臨床應用提供一定理論依據。

[關鍵詞] 血府逐瘀湯;川芎-赤芍;血管新生;網絡藥理學;分子對接

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）06-0033-05

[Abstract] Objective To analyze the material basis and mechanism of key components of Xuefu Zhuyu Decoction on Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra regulating angiogenesis. Methods The constituents of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra and their corresponding target proteins were mined from the TCMSP database and the Drug Bank database， and the angiogenesis-related genes were obtained from the GeneCards database. The target of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra intervention on angiogenesis was obtained using the Venn function in the Omicshare database. The network relationship map of "active component-Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra regulating angiogenesis target protein" was constructed with the help of Cytoscape（3.8.2） software. The interaction network of "Chuanxiong-Radix Paeoniae regulating Rubra angiogenesis target protein-human protein" was constructed in the String database， and the core target was screened. The gene ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the obtained targets were carried out on the Omicshare website. With the help of AutoDock vina software， the core target and key active ingredients were molecularly docked. Results 20 active components of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra， 117 related target proteins， and 72 angiogenesis-regulating target proteins of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra were obtained. Among them， the key active ingredients are baicalein， tannic acid， β-sitosterol， stigmasterol， myricetin， （+） -catechin， ferulic acid， and ligustrazine. The key target proteins were protein kinase Bα （AKT1）， vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， interleukin-6 （IL-6）， P53 tumor protein （TP53）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， cyclooxygenase 2 （PTGS2）， heat shock protein 90αA1 （HSP90AA1）， and c-fos proto-oncogene protein （FOS）. GO results suggested that the drug affects angiogenesis in cell proliferation， growth， bioadhesion， and cell aggregation. Pathway enrichment results showed that the AGE-RAGE pathway， IL-17 pathway， fluid shear stress， and atherosclerosis signaling pathways are the main pathway of drug action. Molecular docking suggested that the core target has an excellent binding ability with key compounds. Conclusion The Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra of Xuefu Zhuyu Decoction can regulate angiogenesis through multiple targets and pathways. It provides a certain theoretical basis for the further research and clinical application of Xuefu Zhuyu Decoction on the intervention of angiogenesis.

[Key words] Xuefu Zhuyu Decoction; Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra; Angiogenesis; Network pharmacology; Molecular docking

血管新生是在已有血管基礎上形成新血管的過程，其異常可導致缺血性疾病（如心肌缺血、缺血性腦卒中）和血管增生性疾病（如腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變），對人類健康威脅巨大。治療血管新生已成為相關疾病研究的熱點之一[1]。

作為活血化瘀方劑的代表，血府逐瘀湯可活血化瘀、調節血管新生，但具體機制尚不明晰[2]。網絡藥理學是基于系統生物學和運籌學的網絡理論，以整體、系統的觀點分析藥物與機體之間的相互作用，對揭示疾病機制和藥物的研發具有重要意義。

在血府逐瘀湯中，川芎為血中氣藥，既能活血化瘀，又擅行氣化滯，芍藥涼血活血、散瘀止痛，二者相互配合而發揮重要作用[3]。因此，本研究選取川芎、赤芍，以網絡藥理學方法分析其調控血管新生的機制，以期為血府逐瘀湯相關臨床應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 獲取川芎-赤芍的活性成分和靶蛋白、血管新生相關基因

在TCMSP數據庫（http：//ibtshk-bu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）挖掘，并依據口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18篩選川芎、赤芍的潛在有效成分，并檢索文獻補充。將所得成分的化學結構在PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行驗證。

通過TCMSP數據庫和Drug Bank（https：//www.drugbank.ca/）數據庫查找有效成分對應靶點，并在UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/up-loadlists/）中轉換成人類基因名。在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）收集血管新生相關基因。

1.2“川芎-赤芍活性成分—藥物調節血管新生靶蛋白”關系網絡構建

利用Venn功能（https：//www.omicshare.com）對川芎-赤芍活性成分靶蛋白和血管新生相關基因取交集，獲取川芎-赤芍干預血管新生的可能靶蛋白。隨后將上述數據導入Cytoscape（3.8.2）軟件，構建“活性成分—川芎-赤芍干預血管新生靶蛋白”關系網絡圖，分析網絡拓撲結構。其中，Degree值代表成分與靶標之間所對應的關系，BC值表示節點和網絡中心點間的距離，兩個參數越大說明該節點在網絡中作用越重要。

1.3“川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白—人類蛋白”相互作用網絡（protein protein interaction network，PPI）構建

將川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白導入String數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），并指定“Homo sapiens”為限定研究物種，獲取蛋白互作信息后，再導入cytoscape中繪制“川芎-赤芍干預血管新生靶蛋白—人類蛋白”PPI，分析網絡拓撲結構，篩選核心靶點。

1.4 核心靶點的GO分析和KEGG通路富集分析

應用BioMart數據庫（http：//www.biomart.org/）轉換核心靶點的基因格式，利用Omishare網站進行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，并依據P值大小展示KEGG結果的前20條（P<0.01）。

1.5 關鍵活性化合物與核心靶點的分子對接

將1.3篩選出的核心靶點在PDB數據庫（https：//www1.rcsb.org/）和UniProit數據庫中轉換成PDB格式，再從TCMSP數據庫下載關鍵活性成分的3D結構。將小分子化合物和大分子蛋白質通過AutoDock軟件分別進行加氫和脫水-加氫處理，設置對接參數及對接BOX，借助AutoDock vina進行運算，再通過PyMol軟件輸出結果。

2 結果

2.1 川芎-赤芍的活性成分和靶蛋白、血管新生相關基因的獲取

獲得310種川芎、赤芍的成分，其中符合方法1.1篩選標準的活性成分37種，經Pubchem數據庫驗證后，最終得到有效活性成分20種（其中1種為二者重復成分），相應靶基因共117個。GeneCards數據庫中獲得血管新生相關基因4609個，應用相關性中位數篩選，得到2327個相關基因。

2.2“川芎-赤芍活性成分—藥物調節血管新生靶點”關系網絡構建

將川芎-赤芍靶蛋白與血管新生相關基因取交集，得到藥物調節血管新生的潛在靶點72個。其對應18個有效成分。構建“川芎-赤芍活性成分—藥物調節血管新生靶點”PPI，分析結果顯示黃芩素（baicalein）、鞣花酸（ellagic acid）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、楊梅酮（myricanone）、（+）-兒茶素[（+）-catechin]、阿魏酸（ferulic acid）、川芎嗪（tetramethylpyrazine）排名位于Degree值和BC值前10位，提示其可能是藥物調節血管新生的關鍵活性成分。上述關鍵活性成分主要來源于赤芍，提示赤芍作用更重要。見圖1、表1。

2.3 “川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白—人類蛋白”PPI構建與分析

“川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白—人類蛋白”PPI分析表明，Degree值和BC值都位于前10的靶點有8個，分別為蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤蛋白p53（tumor protein P53，TP53）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、熱休克蛋白90αA1（heat shock protein 90 Alpha family class A member 1，HSP90AA1）、c-fos原癌基因蛋白（proto-oncogene c-Fos，FOS），提示它們可能為藥對干預血管新生的關鍵靶蛋白。見圖2。

2.4 GO和KEGG分析及核心靶點的確定

對川芎-赤芍調節血管新生靶蛋白進行GO及KEGG分析，以P<0.01為篩選條件，分別得到5438個相關條目和216條富集通路，其中，富集前20條的通路見圖3。

GO分析表明，藥對作用涉及生物過程有27個條目，主要為細胞的增殖、生長、粘附和聚集等方面;相關的分子功能條目有8個，涉及活動分子傳感器、轉錄監管機構活動、抗氧化等方面;細胞組成有14個條目，涉及細胞膜、細胞外區域、突觸等感受外界信號的結構。

KEGG分析結果顯示，相關通路為AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、流體剪應力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathway）信號通路，并且存在多靶點的相互協調作用。

2.5 分子對接

除（+）-catechin因其結構的特殊性，無法進行對接之外，關鍵活性成分與靶蛋白的結合能信息見表2，部分化合物與靶點分子的具體對接過程見封三圖5。結果顯示，其中51個對接結果有較優的對接活性（結合能≤-5.0），29個對接結果有強烈的匹配活性（結合能≤-7.0）。以上結果表明，川芎-赤芍關鍵活性成分與其調節血管新生靶蛋白可有效結合。

3 討論

本研究分析表明，黃芩素、鞣花酸、β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅酮、（+）-兒茶素、川芎嗪和阿魏酸可能為血府逐瘀湯中川芎-赤芍調節血管新生的關鍵活性化合物。川芎嗪可促進血管內皮生長因子（VEGFA）的表達從而促進血管新生[4]。阿魏酸是肉桂酸的衍生物之一，可通過抑制環氧合酶-2（COX-2）和血管內皮生長因子（VEGFA）表達，從而表現出抗血管生成活性[5]。黃芩素屬于黃酮類化合物，其藥理作用與抗炎、抗血管生成、抗轉移有關，可破壞腫瘤血管系統的發育來抑制腫瘤的轉移和進展[6]。鞣花酸是一種多酚二內酯，可下調VEGF基因表達，抑制腫瘤血管生成[7]。β-谷甾醇和豆甾醇屬于植物甾醇，其中β-谷甾醇既能促進創傷愈合過程的血管新生，又顯著抑制VEGFA的表達，抑制腎腫瘤血管新生[8]。而豆甾醇可通過下調TNF-α抑制小鼠的腫瘤血管生成并抑制膽管癌的生長[9]，還可以刺激血管生成從而有益于缺血性疾病的治療[10]。（+）-兒茶素屬于多元酚類的一種，具有明顯的抗血管生成作用，從而抑制腫瘤的生長和擴散[11]。楊梅酮具有強大的抗肺癌活性，但其在血管新生方面的作用還有待進一步研究[12]。

本研究分析提示，AKT1、VEGFA、IL-6、TP53、TNF、PTGS2、HSP90AA1、FOS是川芎-赤芍調節血管新生的關鍵靶點，AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路等為關鍵信號通路。

流體剪切應力（fluid shear stress，FSS）是血流與血管壁內皮表面產生的摩擦力，在血管生物學中起重要作用，參與調控血管新生[13]。作用在血管內皮細胞上的FSS會在短時間內引發一系列的反應，包括調節Krüppel樣因子2和4（Krüppel-like factor 2/4，KLF2/4）轉錄、激活血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）和酪氨酸激酶（TK），以及一氧化氮（NO）的釋放;進而激活MAP激酶、整合素、NF-κB、p21活化激酶和c-Jun N端激酶（JNK）;從而這些通路下游表達不同的轉錄組[14]。

AGE-RAGE信號通路對血管系統的影響主要與炎癥及氧化應激有關[16]。關鍵靶蛋白中的AKT1、IL-6、TNF、VEGFA在該通路中發揮重要作用。AGE-RAGE可降低血管VEGFR2的蛋白質表達，造成血管生成障礙，從而引起一系列糖尿病并發癥[17]。白細胞介素-17（IL-17）信號通路同樣參與調控血管新生的過程。關鍵靶蛋白中的IL-6、TNF在該通路中占據重要地位。IL-17可誘導小鼠體內血管內皮細胞遷移及成血管作用，并增強VEGFA表達，參與腫瘤間質中炎癥反應和微血管形成[18]。

綜上所述，本研究對血府逐瘀湯中的“川芎-赤芍”藥對進行了網絡藥理學分析，定位其調節血管新生的關鍵成分、靶點與可能的作用通路。但本研究通過數據挖掘，對藥物調控血管新生的相關機制進行預測，仍具有一定的局限性，未來還需要在基礎實驗及臨床試驗中進行進一步驗證。

[參考文獻]

[1]? ?Moghiman T，Barghchi B，Esmaeili SA，et al. Therapeutic angiogenesis with exosomal microRNAs：An effectual appr-oach for the treatment of myocardial ischemia[J].Heart Fail Rev，2021，26（1）：205-213.

[2]? ?Hao P，Jiang F，Cheng J，et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease：Evidence and potential mechanisms[J]. J Am Coll Cardiol，2017，69（24）：2952-2966.

[3]? ?袁蓉，施偉麗，信琪琪，等.川芎-赤芍藥對研究進展[J].環球中醫藥，2019，12（5）：808-811.

[4]? ?Qing L，Wu P，Zhou Z，et al. Tetramethylpyrazine improved the survival of multiterritory perforator flaps by inducing angiogenesis and suppressing apoptosis via the Akt/Nrf2 pathway[J]. Drug Des Devel Ther，2019，13：1437-1447.

[5]? ?Ekowati J，Hamid IS，Diyah NW，et al. Ferulic acid prevents angiogenesis through cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor in the chick embryo chorioallantoic membrane model[J].Turk J Pharm Sci，2020，17（4）：424-431.

[6]? ?Park YG，Choi J，Jung HK，et al. Baicalein inhibits tumor progression by inhibiting tumor cell growth and tumor angiogenesis[J]. Oncol Rep，2017，38（5）：3011-3018.

[7]? ?■etin A，Biltekin B. Combining ellagic acid with temozo- lomide mediates the cadherin switch and angiogenesis in a glioblastoma model[J].World Neurosurg，2019，132：e178-e184.

[8]? ?Sharmila R，Sindhu G. Modulation of angiogenesis，proli ferative response and apoptosis by beta-sitosterol in rat model of renal carcinogenesis[J]. Indian J Clin Biochem，2017，32（2）：142-152.

[9]? ?Kangsamaksin T，Chaithongyot S，Wootthichairangsan C，et al. Lupeol and stigmasterol suppress tumor angiogenesis and inhibit cholangiocarcinoma growth in mice via downregulation of tumor necrosis factor-α[J]. PLoS One，2017，12（12）：e0189 628.

[10]? Liu M，Zhao L，Han L.et al. Discovery and identification of proangiogenic chemical markers from Gastrodiae Rhizoma based on zebrafish model and metabolomics approach[J]. Phytochem Anal，2020，31（6）：835-845.

[11]? Yee EMH，Brandl MB，Pasquier E，et al. Dextran-Catechin inhibits angiogenesis by disrupting copper homeostasis in endothelial cells[J]. Sci Rep，2017，7（1）：7638.

[12]? Dai G，Tong Y，Chen X，et al. In vitro anticancer activity of myricanone in human lung adenocarcinoma A549 cells[J]. Chemotherapy，2014，60（2）：81-87.

[13]? Bai L，Shyy JY PhD. Shear stress regulation of endothe- lium：A double-edged sword[J].J Transl Int Med，2018，6（2）：58-61.

[14]? Kumar S，Williams D，Sur S，et al. Role of flow-sensitive microRNAs and long noncoding RNAs in vascular dys- function and atherosclerosis[J].Vascul Pharmacol，2019， 114：76-92.

[15]? Fan Y，Lu H，Liang W，et al. Krüppel-like factors and vascular wall homeostasis[J].J Mol Cell Biol，2017，9（5）：352-363.

[16]? Xu J，Chen LJ，Yu J，et al. Involvement of advanced glycation end products in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Cell Physiol Biochem，2018，48（2）：705-717.

[17]? Kim JH，Kim KA，Shin YJ，et al. Methylglyoxal induced advanced glycation end products（AGE）/receptor for AGE（RAGE）-mediated angiogenic impairment in bone marrow-derived endothelial progenitor cells[J]. J Toxicol Environ Health A，2018，81（9）：266-277.

[18]? 周瓊，董杰，沈夏波，等.白介素-17在三陰性乳腺癌中的表達及其與新生血管和預后的相關性[J].腫瘤學雜志，2021，27（1）：53-57.

（收稿日期：2021-07-13）