坤復康片中異澤蘭黃素小腸吸收特征研究

徐人杰 張濤 潘海滔 欽博 周萍

[摘要] 目的 研究坤復康片中的異澤蘭黃素小腸吸收和坤復康片對其吸收的影響。方法? Caco-2細胞模型研究不同藥物濃度、pH值、溫度和抑制劑對異澤蘭黃素雙向滲透吸收的影響。采用藥動學實驗研究坤復康片在體內對異澤蘭黃素吸收的影響。結果 數據表明，異澤蘭黃素在Caco-2細胞模型中吸收較差，三種待測濃度下其吸收僅為3.27×10-7cm/s至5.37×10-7cm/s[從頂膜端（AP）到底膜端（BL）]和從6.27×10-7cm/s至9.63×10-7cm/s（從BL到AP），其轉運具有pH和溫度依賴性。異澤蘭黃素的細胞通透性受多耐藥蛋白抑制劑MK571和吲哚美辛的影響。當坤復康溶液加入后，異澤蘭黃素的吸收顯著性增加，從4.41×10-7cm/s至6.43×10-7cm/s（從AP到BL）。在藥動學實驗中，坤復康組的異澤蘭黃素相對于單體組有更大的吸收入血暴露量。 結論? 坤復康片中某些成分會顯著促進異澤蘭黃素的吸收。

[關鍵詞] 異澤蘭黃素;Caco-2;口服;吸收機制;坤復康片

[中圖分類號] R969.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）06-0038-05

[Abstract] Objective To study the small intestinal absorption of eupatilin in Kunfukang tablets and the effect of Kunfukang tablets on its absorption. Methods Caco-2 cell model was used to study the effects of different drug concentrations， pH values， temperatures， and inhibitors on the bidirectional permeation and absorption of eupatilin.? Pharmacokinetic experiments were used to study the effect of Kunfukang tablets on the absorption of eupatilin in vivo. Results Data showed that eupatilin was poorly absorbed in the Caco-2 cell model， and its absorption was 3.27×10-7cm/s to 5.37× 10-7cm/s （from AP to the BL） and from 6.27×10-7cm/s to 9.63×10-7cm/s（from BL to AP） at three concentrations to be measured. Its transport was pH and temperature-dependent. The cell permeability of eupatilin was affected by the multidrug resistance protein inhibitors MK571 and indomethacin. After the addition of Kunfukang solution， the absorption of eupatilin significantly increased， from 4.41×10-7cm/s to 6.43×10-7cm/s （from AP to BL）. In the pharmacokinetic experiment， the absorption exposure of eupatilin in the Kunfukang group was greater than that in the monomer group. Conclusion Some components in Kunfukang tablets can significantly promote the absorption of eupatilin.

[Key words] Eupatilin; Caco-2; Oral; Absorption mechanism; Kunfukang tablets

坤復康片是著名的中藥配方，包括赤芍、苦參、香附、豬苓、女貞子、南劉寄奴、烏藥、粉萆解、扁蓄等幾種中藥材，臨床用于治療中國女性的骨盆炎癥[1-3]。異澤蘭黃素是坤復康片中最重要的黃酮類化合物之一，來源于南劉寄奴[4]。各種藥理研究表明，異澤蘭黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗過敏等作用[5-8]。研究表明異澤蘭黃素的絕對生物利用度偏低[9-10]。小腸吸收障礙是影響外源性物質生物利用度的重要因素[11-12]。探討異澤蘭黃素的腸道吸收機制不僅是研究其體內藥代動力學所必需的，還為其起效機制提供了關鍵信息。本研究旨在通過體外Caco-2實驗和體內藥動學實驗揭示異澤蘭黃素的小腸吸收機制，并探討坤復康片對異澤蘭黃素口服吸收的影響[13-16]，現報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

1.1.1? 試劑? Transwell 轉運小室（12孔，0.4 μmol/L）;96 孔細胞培養板、培養瓶（Corning 公司，美國）。緩沖鹽溶液（hanks balanced salt solutions，HBSS），二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），DMEM培養基由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。坤復康片（陜西康惠制藥股份有限公司，批號 200901）均為市售品。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazo liumromide，MTT）購自白鯊生物科技有限公司;細胞Caco-2 細胞株，購自中國科學院上海細胞庫，代數在35～50代。

1.1.2? 儀器? Applied Biosystem 5500 QTRAP?hybrid triple-quad 三重四極桿質譜（美國AB科學技術公司）;ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（美國安捷倫科技有限公司，50 mm×2.1 mm，1.8 μmol/L）。跨膜電阻儀（Millicell ERS system，Millipore，MA，美國）。

1.2? 方法

1.2.1? 色譜及質譜條件? 流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B）。梯度洗脫如下：0～5.0 min，1.0→95.0% A;5.0～7.0 min 95.0% A;7.0～7.1 min，95.0→1.0% A;7.1～9 min， 1.0% A。在線脫氣;流速：0.4 ml/min;柱溫：30℃;進樣量：2 μl。

ESI離子源，負離子模式;采集方式多反應監測（MRM）。m/z 343.0 → 328.0（異澤蘭黃素），m/z 415.1 → 267.1（葛根素，內標），碰撞能量（CE）：-26 V（異澤蘭黃素），-40 V（葛根素）。

1.2.2? 坤復康溶液的配制? 坤復康片研磨后用水充分溶解后超聲離心沉淀，收集水溶液1 ml置于10 ml容量瓶中定容。異澤蘭黃素在坤復康片中的含量約為2.012 mg/g，在坤復康水溶液中約為5.850 μmol/L。

1.2.3? 標準溶液的配制? 精密稱取異澤蘭黃素對照品適量，用DMSO 配制成濃溶液，實驗前用HBSS（用于Caco-2實驗）或甲醇（用于藥動學實驗）稀釋至所需藥物濃度。

1.2.4? 樣本處理? 培養基或大鼠血漿樣品50 μl，加入70 ng/ml葛根素甲醇溶液10 μl，補足390 μl甲醇，渦旋離心后吸取2 μl上清進樣LC-MS/MS分析。

1.2.5? Caco-2細胞毒? 采用MTT法檢測異澤蘭黃素的細胞毒性。

細胞存活率（%）=A 實驗組/A 對照組×100%。

1.2.6? 轉運實驗? 研究異澤蘭黃素在5、20、80 μmol/L下的轉運行為。4℃和37℃下研究溫度對轉運的影響。研究pH 6.0或pH 7.4對異澤蘭黃素轉運的影響。

將若干種抑制劑分別預處理轉運體系研究幾種轉運蛋白的影響，包括P-糖蛋白（p-glycoprotein， p-gp）抑制劑維拉帕米;多耐藥蛋白（multidrug resistance-related proteins，MRPs）抑制劑MK571、苯溴馬隆（multidrug resistance-related protein 3，MRP3）和吲哚美辛（multidrug resistance-related protein 2，MRP2）;乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）抑制劑芹菜素。通過添加釩酸鈉和西咪替丁評估Na/K-ATPase的選擇性;加入左旋肉堿或奎尼丁評估有機陽離子/麥角硫因轉運蛋白（recombinant organic cation/erg-othioneine transporter，OCTN1）或OCTN2蛋白是否參與到異澤蘭黃素的跨膜轉運中。

1.2.7? 藥動學實驗? 所有動物實驗均按照上海交通大學實驗動物中心指南和規章制度操作，并通過上海交通大學動物倫理委員會審核。Sprague-Dawley（SD）大鼠（210～230 g）由上海交通大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（滬）2017-0004。分別灌胃口服異澤蘭黃素混懸液20 mg/kg或坤復康溶液10.58 g/kg（含約20 mg/kg異澤蘭黃素）。

1.3? 觀察指標及評價標準

Caco-2實驗結果由表觀滲透系數（apparent permeability，Papp）值和外排率（efflux ratio，ER） 值表示。

PappP=（dQ/dt）/（A·C0）;ER=PappBA/ PappAB

式中：A 為Transwell 小室的有效面積;dQ/dt為轉運速率;C0為藥物的初始濃度;PappBA為BL 到AP側的Papp值;PappAB 為AP 到BL 側的Papp值。當ER > 1.5提示可能存在主動轉運，ER≤1.5提示以被動擴散為主[17]。

藥動學數據由給藥后的藥-時曲線及藥動學參數表示。

1.4? 統計學方法

質譜數據通過 Analyst 1.5.2和MultiQuant 3.0.0軟件處理，藥動學數據通過DAS 2.0軟件分析，統計學數據用SPSS 20.0 統計學軟件進行處理，所有統計數據用均數±標準差（x±s）表示，各組間差異用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 異澤蘭黃素的含量測定

代表性質譜圖如圖1所示，該測定方法下異澤蘭黃素在培養基和血漿中的線性范圍分別為2.5 ng/ml至500 ng/ml和5 ng/ml至500 ng/ml。

2.2? 細胞毒實驗

結果顯示，異澤蘭黃素濃度小于200 μmol/L或濃度為0.58 mg/ml坤復康溶液對Caco-2細胞生長抑制率小于10%。

2.3? 濃度和時間對異澤蘭黃素轉運的影響

異澤蘭黃素三種濃度下的PappAB從3.27×10-7cm/s至5.37×10-7cm/s（從AP到BL）和從6.27×10-7cm/s至9.63×10-7cm/s（從BL到AP）。見圖2。

異澤蘭黃素在檢測時間段內隨時間呈線性增長，表明異澤蘭黃素的轉運有時間依賴性。

2.4? pH和溫度對Caco-2細胞轉運異澤蘭黃素的影響

異澤蘭黃素在pH 7.4時的PappAB值明顯高于在pH 6.0時的PappAB值（P<0.05）。見圖3。

溫度降低會降低細胞的新陳代謝，降低異澤蘭黃素轉運效率[18]。低溫（4℃）孵育使PappAB從4.90×10-7cm/s降低到1.91×10-7cm/s。見圖3。

2.5? 異澤蘭黃素在Caco-2細胞上轉運結果

在MK 571預處理的情況下，異澤蘭黃素的PappAB幾乎是對照組的2.7倍，而其PappBA值則降低38.26%。文獻報道表明， MRP2和MRP3分別存在Caco-2細胞的頂膜端和基底端[19-20]。吲哚美辛是一種MRP2抑制劑，顯著提高了異澤蘭黃素的PappAB值（P<0.05）。見表1。此外，當加入坤復康片處理液后，異澤蘭黃素的PappAB顯著性升高。

2.6? 體內藥動學研究

坤復康組中異澤蘭黃素的Cmax值為單體組的127.60%，兩組達峰時間（Tmax）比較，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組中異澤蘭黃素的血漿暴露量（AUC0-t和AUC0-∞）比較，差異有統計學意義（P<0.05），但MRT和t1/2值無顯著差異，說明坤復康片中其他成分主要影響異澤蘭黃素的吸收相。見表2、圖4。

3? 討論

優良的口服吸收特征是新藥試驗篩選過程中的重要條件，而藥物溶解度和胃腸通透性又是影響口服吸收效率的主要因素。一般來說，藥物的溶解度和滲透性取決于親脂性等因素，但預測口服給藥后藥物在人體中的吸收能力相對復雜。Caco-2細胞在體外分化成人體腸道上皮細胞時可以表達腸道特異性水解酶。此外，Caco-2細胞可以模擬人類腸道中的上皮細胞表達P-gp和其他膜轉運蛋白。因此，Caco-2細胞模型常用于探討藥物在人體腸道中的吸收和轉運機制。

一般認為，Papp值<1×10-6cm/s的化合物被認為吸收率低（<30%），Papp值在1×10-6cm/s和1×10-5cm/s之間的化合物被認為具有中等吸收（30%～70%），而Papp值>1×10-5 cm/s被認為具有高吸收（>70%）[21]。異澤蘭黃素Papp值的結果表明了其在腸中吸收較差，與口服生物利用度低一致，因此較低的腸道滲透性可能是造成異澤蘭黃素生物利用度低的一個原因。同時，異澤蘭黃素吸收的ER>1.5，提示可能存在主動轉運。

肝臟代謝也是導致口服生物利用度低的一個重要原因。異澤蘭黃素是黃酮類化合物的一種。事實上，其他一些常見的黃酮類化合物，如蘆丁[22]和黃芩苷[23]，可以在體內發生強代謝。藥物的體內過程十分復雜，需要更多的研究來解釋口服生物利用度低的現象。

在預實驗中，嘗試按大鼠單次給藥的臨床等效劑量（約108 mg/kg坤復康片）進行藥動學實驗分析體內過程，但由于其入血含量低，在現有LC/MS/MS條件下，無法在血漿中定量異澤蘭黃素，嘗試在正式實驗中加大給藥劑量（10.58 g/kg）以達到檢測目的。因此本藥動學實驗未考慮增加劑量對被測化合物體內過程的影響，實驗結果仍需要進一步驗證。

實驗結果顯示，復方成分對異澤蘭黃素有增加吸收作用。該結果證明方劑配伍可明顯影響活性化學成分在體內的藥物動力學行為，說明在中醫辨證理論指導下的復方配伍原則具有豐富的科學內涵。大多數中藥單體成分的體外活性弱于天然藥物，如黃芩苷、小檗堿、燈盞花素、丹酚酸等。但絕大部分傳統草藥是通過口服給藥，這就讓多成分相互作用提高單一成分的生物利用度成為可能。目前，關于單體聯合給藥的研究主要集中在藥效學的關聯效應上，而關于藥動學的研究則很少。本研究從小腸吸收及藥動學的角度，為如何提高天然產物生物利用度的問題提供新的解決思路及數據參考。根據文獻報道[24]，除異澤蘭黃素外，坤復康片的主要活性成分還包括氧化苦參堿、苦參堿、紅景天苷等，中藥的復方成分之間的相互作用不局限于吸收階段，對此將進一步深入研究。

[參考文獻]

[1]? ?Xu RJ，Yu BM，Wang SQ，et al. Characterization of the intestinal absorption of morroniside from Cornus officinalis Sieb. et Zucc via a Caco-2 cell monolayer model[J]. Lat Am J Pharm，2020，39（8）：1500-1508.

[2]? ?趙子劍，陳迪釗.坤復康膠囊對慢性盆腔炎大鼠細胞因子的影響實驗[J].時珍國醫國藥，2010，21（12）：3054-3055.

[3]? ?衛昊，侯建平，郭惠玲，等. 坤復康膠囊對混合菌液致盆腔炎模型大鼠血液流變學和病理形態學的影響[J]. 中藥藥理與臨床，2012，28（3）：92-94.

[4]? Zhu HY，Guan J，Zhang H，et al. Simultaneous deter- mination of ferulic acid，paeoniflorin， and eupatilin in rat plasma by ultra-high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry：Application to a pharmacokinetic study of Danggui-Shaoyao-San[J]. J Sep Sci，2020，43（11）： 2053-2060.

[5]? ?肖永慶， 屠呦呦.中藥南劉寄奴化學成分研究[J]. Journal of Integrative Plant Biology，1986，1986（3）：307-310.

[6]? ?王小俊，陳林霖，方穎. 異澤蘭黃素的藥理作用研究進展[J]. 時珍國醫國藥，2019，30（3）： 665-668.

[7]? ?吳志賢，李響，莫自增，等. 異澤蘭黃素通過PDGFβ/ERK信號通路抑制增生性瘢痕生長的機制探討[J]. 中國美容醫學，2019，28（7）：44-47.

[8]? ?劉瑞. 艾葉提取物異澤蘭黃素誘導肝癌細胞凋亡機制的研究[D].廣州： 南方醫科大學，2019.

[9]? ?何瑾瑜，祁海燕，楊躍青，等. 異澤蘭黃素對肝癌細胞SK-HEP-1增殖、凋亡以及作用機制的影響[J]. 臨床和實驗醫學雜志，2019，17（24）：2602-2606.

[10]? Geng P W，Luo XH，Peng XF，et al. Development and valid-ation of UPLC-MS/MS method for determination of eupa-tilin in rat plasma and its application in a pharmac-okinetics study[J].Acta Chromatogr，2018，30（4）：231-235.

[11] Wang XX，Ren J，Zhu SX，et al. Pharmacokinetics and tissue distribution of eupatilin and its metabolite in rats by an HPLC-MS/MS method[J].J Pharmaceut Biomed，2018，159：113-118.

[12]? Peng Y，Fan M，Peng CS，et al. Alleviating the intestinal absorption of rhein in rhubarb through herb compatibility in Tiaowei Chengqi Tang in Caco-2 cells[J].Evid-based Compl Alt，2018：7835 128.

[13]? US Department of Health and Human Services，Food and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for Industry，Bioanalytical Method Validation，May 2001. doi：Available from： http：//www.fda.gov/ downloads/Drugs/Guidance Compliance Regulatory Information/ Guidances/ ucm070107.pdf （accessed 26.08.11）.

[14]? Xu RJ，Peng Y，Wang MY，et al. Intestinal absorption of isoalantolactone and alantolactone，two sesquiterpene- lactones from radix inulae，using Caco-2 cells[J].Eur J Drug Metab Ph，2018，44（2）：295-303.

[15]? Lu J，Liu L，Zhu X，et al. Evaluation of the absorption beha- vior of main component compounds of salt-fried herb ingredients in qing'e pills by using caco-2 Cell model[J]. Molecules，2018，23（12）：3321.

[16]? 程珍珍，周本宏，姜姍，等.沒食子酸在Caco-2 細胞模型中的吸收轉運研究[J].中國藥理學通報，2020，36（8）：1183-1184.

[17]? 張馨，王莉芳，陳佳琪，等.龍血竭酚類提取物主要成分在Caco-2 細胞中吸收機制研究[J].中國中藥雜志，2020， 45（20）：4889-4895.

[18]? Rocha RA，Devesa V，V′elez D. In vitro study of intes- tinal transport of fluoride using the Caco-2 cell line[J]. Food Chem Toxic，2013，55：156-163.

[19]? Duan J，Xie Y，Luo H，et al. Transport characteristics of isorhamnetin across intestinal Caco-2 cell monolayers and the effects of transporters on it[J].Food Chem Toxic，2014，66：313-320.

[20]? Prime-chapman HM，Fearn RA，Cooper AE，et al. Differe- ntial multidrug resistance-associated protein 1 through 6 isoform expression and function in human intestinal epithelial Caco-2 cells[J].J Pharmacol Exp，2004，311（2）：476-484.

[21]? Willenberg I，Michael M，Wonik J，et al. Investigation of the absorption of resveratrol oligomers in the Caco-2 cellular model of intestinal absorption[J].Food Chem，2015， 167：245-250.

[22]? 高慧敏，王智民，田娟.燈盞花素在正常和模型大鼠中的藥代動力學及代謝物研究[J].藥學學報，2005，40（11）：1024-1027.

[23]? 解立科，田小亭，郭小珍，等.黃芩素與黃芩苷微生物和肝臟代謝異同研究[J].中成藥，2020，42（7）：1830-1836.

[24]? 趙瑩.HPLC-MS/MS法同時測定坤復康片中5種有效成分的含量[J].沈陽藥科大學學報，2015，32（11）：869-974.

（收稿日期：2021-03-15）