系統性紅斑狼瘡患者尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征的相關性研究

余楷 何詩雅 陳麗瑩 韓婷芬 楊科朋 王新昌

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身免疫介導的以免疫性炎癥為突出表現的彌漫性結締組織病，血清中多種自身抗體的產生和多系統受累是SLE 的兩個主要特征[1]。臨床上，尿液標志物的評估常常被忽略。犬尿氨酸（kynurenine，KYN）是吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenas，IDO）作用下的色氨酸（tryptophan，TRP）代謝產物。干擾素α（interferon α，IFN-α）等炎癥因子可影響IDO 活性，造成TRP-KYN 通路失衡。研究表明，SLE 等自身性免疫疾病中伴有抑郁、焦慮和認知缺陷患者的KYN/TRP 比值存在異常[2]。SLE患者血清色氨酸濃度較正常人降低，KYN 水平和IDO 活性較正常人顯著增高[3]。TRP-KYN 通路是免疫系統和神經系統之間相互影響的關鍵界面。IFN-α在SLE 的發病中起著至關重要的作用[4]，SLE 患者出現精神異常的分子機制很可能與IFN-α 等炎癥因子誘導的TRP-KYN 通路異常有關。因此，為了尋求尿液中評價SLE 患者的生物標志物。本研究應用酶聯免疫吸附測定（ELISA）分析SLE 患者尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2020 年6 月至2021 年5 月就診于浙江大學附屬第二醫院及浙江中醫藥大學附屬第二醫院風濕免疫科確診為SLE 的患者75 例。本研究通過浙江大學附屬第二醫院及浙江中醫藥大學附屬第二醫院倫理委員會的批準[審批號：2020-KL-002-IH01，（2020）倫審研第（751）號]，所有患者在受試前已經簽署相關知情同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）符合2012 年SLICC 制訂的SLE 分類標準[5]；（2）年齡14～65 歲；（3）患者知情并同意參加本研究。排除標準：（1）終末期腎病、Ⅳ級心力衰竭、肝衰竭、惡性腫瘤患者；（2）合并其他自身免疫病患者；（3）哺乳期女性。

1.3 方法

1.3.1 臨床特征 記錄患者的一般情況，包括性別、年齡、病程、治療藥物等。

1.3.2 尿液IFN-α、TRP、KYN 水平檢測 采集患者尿液5mL，將尿液凍存于－80℃備用。采用南京草本源生物科技有限公司ELISA 試劑盒（人IFN-α ELISA 試劑盒，批號20 210503；人TRP ELISA 試劑盒，批號20210503-1；人KYN ELISA 試劑盒，批號20210503-02）進行尿液中IFN-α、TRP、KYN 水平檢測。具體步驟：用無菌管收集尿液，離心20min（2000～3000r/min），仔細收集上清。分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋40μL，然后再加待測樣品10μL（樣品最終稀釋度為5 倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。每孔加入酶標試劑100μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育60min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5 次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。每孔加終止液50μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中尿液IFN-α 含量。尿液TRP、KYN 水平檢測方法同上。

1.3.3 疾病活動度評分 系統性紅斑狼瘡疾病活動性評分[1]（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLE-DAI）對SLE 病情進行判斷：0～4 分為基本無活動；5～9 分為輕度活動；10～14 分為中度活動；≥15 分為重度活動。以上計分為近10d 之內的癥狀和檢查。

1.3.4 生存質量評估 通過官網（http://www.corptransinc.com），獲取中文版狼瘡生活質量量表（LupusQoL-China）及使用權。該量表包括34 條目，分為8 個維度，分別為：軀體健康、疼痛、計劃性、性生活、對他人的負擔、情緒健康、自我形體評價和疲勞。量表為Likert 5 級選擇量表，1～5 級分別代表“一直如此”“大多數時間”“很多時間”“偶爾”“從不”，計分分別為0～4 分。

1.3.5 統計學方法 應用SPSS 20.0 軟件統計處理和分析數據。對患者一般情況和疾病活動度進行統計描述。組間比較采用秩和檢驗；相關性分析采用Pearson 相關分析。以P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLE 患者臨床特征 75 例SLE 患者女73 例，男2 例；年齡20～64（40.2±11.46）歲，＞60 歲的患者較少；病程＜5 年27 例，5～10 年24 例，＞10 年24 例；治療方案多以激素+免疫抑制劑或激素+免疫抑制劑+中藥治療為主；大多數患者病情控制良好，基本無活動者41 例，輕度活動26 例，中度活動6 例，中度活動2 例；生存質量評分（109.8±15.4），＜100 分者有18例，100～109 分15 例，110～119 分19 例，≥120 分23例。見表1。

表1 系統性紅斑狼瘡患者臨床特征（n=75）

2.2 SLE 尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征的相關性分析 SLE 患者尿液IFN-α 水平與病程、年齡、生存質量評分、KYN/TRP 比值、治療藥物無相關性，差異無統計學意義（P＞0.05）；SLE 患者尿液TRP、KYN、KYN/TRP 比值顯示與病程、年齡、生存質量評分、治療藥物無相關性。但尿液IFN-α 水平與疾病活動度呈顯著正相關（r=0.254，P＜0.05），見表2，圖1。

表2 SLE 尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征相關性分析

圖1 尿液IFN-α 水平與SLE-DAI 評分相關性（P＜0.05）注：SLE-DAI 為系統性紅斑狼瘡疾病活動性評分；IFN-α 為干擾素α

3 討論

本研究結果顯示，SLE 好發于40 歲左右的育齡期女性，病程可超過10 年。患者長期激素、免疫抑制劑和中藥等維持治療基本能控制病情于穩定。大多數SLE 患者生活質量下降。約91%SLE 患者會出現疲勞、頭痛、情緒改變和認知障礙等非特異性的表現[6]。這些“輕微”神經精神癥狀對患者的生活質量有著顯著的影響。然而這些表現相對隱匿，沒有明顯的腦部影像學改變，臨床上常常忽視對這方面的關注。

TRP-KYN 通路與抑郁和精神分裂癥等多種精神和心理健康疾病有著密切的關系，在神經系統中發揮著重要的作用[7-9]。IDO 主要存在于肝臟以外的組織細胞中，包括星形膠質細胞、小膠質細胞、單核-巨噬細胞、血管內皮細胞等，是肝臟以外催化TRP 沿KYN 通路代謝的唯一限速酶。IDO 受IFN-α的轉錄調控，也可受其他一些細胞因子的誘導增多，反之，又可通過CD19+DC 中B7 信號的反應參與IFN-α 水平的調控。這種雙向反饋回路可能是預防過度炎癥和自身免疫反應的一部分[10]。IDO 的增多促進TRP 朝著TRP-KYN 通路分解代謝，造成下游代謝的失衡，從而引發了如神經系統改變的臨床表現（見圖2）。

圖2 IFN-α 誘導的TRP-KYN 通路失衡示意圖

SLE 小鼠的代謝組學研究發現，SLE 存在TRP代謝失常[11]。Pertovaara等[12]研究發現，IDO 機制與SLE 發展進程相關，在相同條件下，SLE 患者與健康對照者相比，血清TRP 濃度降低、代謝產物KYN 增高，IDO 活性也明顯增高。Akesson等[13]研究發現，SLE患者與對照組相比，TRP-KYN 通路中的下游代謝物喹啉酸和犬尿喹啉酸發生了改變。因此，TRP-KYN通路上的相關代謝指標極有可能成為反映SLE 患者“輕微”神經精神癥狀的生物標志物。但是本研究沒有發現尿液中TRP、KYN 及其比值與疾病活動度、生存質量評分等臨床特征的相關性，與IFN-α 也無相關性。造成SLE 患者精神改變和生活質量影響的因素是多方面的，可能無法單單用一條通路、幾個指標去衡量，后續可進行多通路，多組學的探索。此外，尿液作為代謝產物的去路之一，能一定程度反映人體的某些代謝情況，但是亦有諸多不穩定的影響因素，包括代謝產物在尿液中的進一步反應降解等。對血漿、腦脊液的檢測可能會更穩定、更準確地反映體內代謝水平的變化。

本研究發現，SLE 患者尿液IFN-α 水平與SLE疾病活動度呈顯著正相關。既往研究表明，IFN-α 是SLE 發病的重要免疫細胞因子，在對抗病毒感染、抑制腫瘤生長、調控細胞分裂、參與免疫系統活化中起著重要的作用[4]。Niewold等[14]發現，SLE 患者及其健康親屬的IFN-α 活性高于正常人，具有明顯的家族聚集性。對SLE 患者滑膜組織的直接分析顯示，IFN誘導基因上調[15]。SLE 患者外周血淋巴細胞IFN-α基因的表達水平比健康志愿者外周血淋巴細胞高3倍。并隨著臨床癥狀改善而降低[16]。有報道，NZB/NZW F1 模型小鼠體內誘導產生IFN-α，在發生明顯的病理學改變之前，這些小鼠在遺傳上易患自發性狼瘡樣疾病，加速了狼瘡自身抗體的產生和組織損傷[17]。IFN-α 在SLE 中有多種致病機制。異常增多的IFNα 通過調控免疫系統相關細胞的生存、活化及功能，促進SLE 的發生發展。SLE 目前臨床診斷和治療干預措施的選擇主要依賴臨床表現和血清學檢查的復合評估。尿液生物標志物作為無侵入性評估工具以準確判斷SLE 的疾病活動及預后很有吸引力。本研究結果顯示，尿液IFN-α 作為SLE 患者臨床疾病活動度生物標志物潛力，但仍需大樣本的臨床實驗驗證其可靠性。

綜上所述，本研究未發現TRP-KYN 通路與SLE臨床特征存在相關性，SLE 患者尿液IFN-α 水平與SLE-DAI 呈正相關，可能可以作為評估SLE 疾病活動的客觀指標，值得進一步研究。