槲皮素抗非小細胞肺癌的靶點預測與驗證

賀肖夢 鄭燕 徐煜彬

槲皮素是一種各類植物中廣泛存在的天然黃酮類有機化合物，化學結構如圖1。槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎和免疫調節等多種藥理學活性，在觸發與化學預防有關的多種細胞內途徑（如凋亡、細胞周期、解毒、抗氧化復制、細胞侵襲、血管生成）中發揮多效作用[1-2]。研究顯示，槲皮素可以抑制NSCLC 腫瘤細胞株的增殖[3]，而槲皮素的抗NSCLC具體靶點尚不明確，仍需進一步探討。本文采用系統的生物信息學研究方法，聯用多個數據庫分析并驗證槲皮素抗NSCLC 的潛在靶點，為后續深入研究奠定基礎。

圖1 槲皮素的分子結構

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 網絡數據庫及工具 槲皮素sdf 文件（PubChem CID:52803430）；TCMSP 數據庫（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；Comparative Toxi -cogenomics Database（https://ctdbase.org/）；Swiss TargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）；Therapeutic Target Database（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）；分子對接服務器（https://www.dockingserver.com/web/docking/449200/?）。

1.1.2 細胞、實驗藥物與試劑

NSCLC 細胞系A549、H1975 購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，RPMI1640 培養基（22400089）購自Gibco 公司，胎牛血清（GNM12250）購自浙江吉諾生物醫藥技術有限公司。槲皮素（69022033）購于國藥集團化學試劑有限公司。CDK1抗體（ab201008）購自Abcam 公司，BCA 蛋白定量試劑盒（WLA004a）、β-actin 抗體（WL01372）、ECL 顯影試劑盒（WLA003a）等均購于沈陽萬類生物科技有限公司，CCK8 試劑盒（C0038）購自碧云天生物。

1.2 方法

1.2.1 關鍵藥理學和分子特性參數 TCMSP 數據庫提供槲皮素體內吸收、分布、代謝及排泄過程（ADME）和分子特性數據，有助于評價藥物成藥性。

1.2.2 藥物和疾病靶點預測 應用CTD 對槲皮素進行化學-蛋白/基因相互作用分析，Swiss Target Prediction 則基于藥物2D/3D 結構，各自篩選數據庫中可能的藥物作用靶點。應用TTD 預測NSCLC 疾病中的關鍵基因。

1.2.3 分子對接篩選靶點 在分子對接服務器上輸入候選靶點蛋白PDB ID，上傳槲皮素sdf 文件，模擬分子對接篩選作用靶點。

1.2.4 細胞培養 A549、H1975 細胞以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基（1%雙抗），培養于37℃，5%CO2的恒溫細胞培養箱。相關實驗均選用對數生長期細胞進行。

1.2.5 Western blot 實驗驗證槲皮素對NSCLC 細胞CDK1 表達的影響 NSCLC 細胞系A549、H1975 以1×106個/孔接種于6 孔板，37℃，5%CO2條件下，培養24h。觀察細胞已貼壁且呈正常生長形態，即可進行梯度濃度給藥，分別以槲皮素0、15、30μM 作用48h。提取細胞總蛋白，BCA 法定量。以30μg/孔上樣量進行電泳分離，分離后蛋白轉至PVDF 膜，含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2h，TBST 清洗10min，重復3次。CDK1 的抗體液（1∶800）和β-actin 的抗體液（1∶1000）4℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜，二抗（濃度分別為1∶1600 和1∶2000）室溫搖床孵育2h，TBST 洗膜，ECL 發光顯影，凝膠成像儀記錄。

1.2.6 CCK8 實驗驗證槲皮素對NSCLC 細胞增殖的影響 NSCLC 細胞系A549、H1975 以8×103個/孔接種于96 孔板，37℃，5%CO2條件下，培養24h。觀察細胞已貼壁且呈正常生長形態，即可進行梯度濃度給藥。槲皮素濃度分別為0、15、30μM，另設空白對照，每組3 個復孔，控制培養基體積200μL，繼續培養48h。每孔加入CCK8 試劑20μL，細胞培養箱繼續孵育2h 后，酶標儀測定各孔OD450 值。

1.3 統計學方法 應用Graphpad Prism 5 軟件處理分析數據并作圖，組間差異分析采用t-test，雙側檢驗，95%置信區間。

2 結果

2.1 槲皮素ADME 和分子特性參數 利用TCMSP數據庫獲得槲皮素體內過程的ADME 和分子特性參數，見表1。

表1 槲皮素藥理參數

槲皮素符合TCMSP 平臺建議的藥物篩選標準（OB≥30%，DL≥0.18），且其口服生物利用率高（OB=46.43%，RBN＜10），HL≥8h 則表明其屬于慢速消除組，半衰期較長。Lipinski 5 原則是根據口服藥物總結出的經驗型規律，是篩選類藥分子的基本法則[4]。槲皮素的MW＜500Da，LogP＜5，Hdon=5，Hacc 和RBN 均小于10，表明槲皮素具有較好的藥代動力學性質。以上數據提示槲皮素成藥性良好，具有一定的應用前景。

2.2 槲皮素抗NSCLC 候選靶點 正確篩選靶向蛋白是藥物研發中的關鍵步驟。本研究利用CTD 數據庫發現槲皮素潛在靶點共778 個；從Swiss Target－Prediction 篩選出前100 個潛在藥物靶點，兩個數據庫交集靶點共46 個。TTD 直接檢索NSCLC 疾病靶點基因共82 個。綜合考慮藥物和疾病靶點，共發現潛在目標靶點9 個，見表2。

表2 槲皮素抗NSCLC 候選靶點

2.3 候選靶點分子對接篩選 分子對接結果顯示，槲皮素與CDK1、CDK2 和CDK6 的結合能均較低，其中與CDK1 達到-7.85kcal/mol，表明兩者對接結果較穩定（見圖2）。槲皮素與CDK1 可能通過疏水殘基LEU135、ILE10、VAL18 和PHE80 等發生相互作用，進而發揮藥理學效應。

圖2 槲皮素與CDK1 分子對接示意圖

2.4 槲皮素對NSCLC 細胞CDK1 表達和細胞增殖的影響

在A549 細胞中，15μM 和30μM 槲皮素均能減少CDK1 的表達，而在H1975 中僅30μM 槲皮素能有效降低CDK1 水平（見圖3）。雙細胞系實驗結果證實，體外實驗中30μM 槲皮素能有效減少NSCLC 細胞中CDK1 的表達，可能進一步影響腫瘤細胞周期，阻滯細胞惡性增殖。

圖3 槲皮素降低NSCLC 細胞CDK1 表達水平

進一步實驗結果顯示，30μM 濃度的槲皮素對兩個NSCLC 細胞系的增殖抑制作用均具有統計學意義（見圖4）。其中A549 細胞系更為敏感，兩個藥物濃度均能有效降低細胞增殖速率（P＜0.01）。槲皮素的細胞增殖實驗結果與其對CDK1 表達水平改變相一致，提示槲皮素可能通過降低細胞CDK1 表達水平發揮抗NSCLC 作用。

圖4 槲皮素抑制NSCLC 細胞增殖

3 討論

NSCLC 占臨床肺癌的近85%，是癌癥相關死亡的主要原因之一[6]。NSCLC 起病多隱匿，早期癥狀不明顯，導致疾病常在中晚期才被確診，使手術切除等早期治療手段無法及時實施，延誤了最佳治療時機[7]。此外，肺癌靶點治療藥物耐藥現象頻發，限制了肺癌靶向治療的臨床療效[8]。尋找新型靶點治療藥物已成為當前肺癌治療藥物的研究重點。有研究指出，槲皮素對肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和結腸癌等多種腫瘤均具有良好的抗癌活性[9]，其抗腫瘤作用具有良好的研究前景。

CDK1 是細胞周期調控中的關鍵性激酶，主要與細胞周期蛋白B（cyclinB）相互作用來驅動G2-M 轉換，也可與其他間期細胞周期蛋白結合（cyclin D1、E、A）調節G1 進展和G1-S 轉換[10]。疾病進展中，CDK1 的高表達誘導NSCLC 的細胞周期加速，抑制細胞凋亡，同時影響患者對順鉑的耐藥性[11]。研究表明，通過下調CDK1 表達能有效抑制NSCLC 細胞增殖和遷移，同時通過使細胞周期停滯在放射敏感的G2/M 期，有助增強放射治療療效[12]。本研究結果顯示，一定濃度槲皮素有效降低NSCLC 細胞CDK1 表達的同時能抑制細胞增殖，且兩者變化相一致。后續將構建shRNA 進一步研究槲皮素通過調節CDK1水平對細胞增殖、遷移能力的影響及其可能作用的下游通路，同時探討其對藥物耐藥和放射敏感性的有益作用。