糖皮質激素對結核性腦膜炎大鼠腦組織血管內皮生長因子及受體表達的影響研究

代傳揚 管弦樂 秦冠南△

(1.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550001；2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

結核性腦膜炎(TBM)是由結核分枝桿菌經血行或直接侵入中樞神經系統引起的非化膿性炎癥性疾病，也是肺外結核中最嚴重的形式，其發病率約占結核患者的10%，致死率、致殘率高[1]。文獻[2]報道，TBM未經治療的患者死亡率接近100%；在接受治療的兒童中，死亡約為20%，另有50%的患者遺留長期神經功能缺損；對于合并艾滋病者，治療后死亡率約為60%。這既與TBM的早期癥狀不典型，易導致誤診有關，也與其治療方案尚不統一有關。TBM作為感染性疾病，抗炎治療是提高其療效的主要手段之一。早在1952年，有學者[3]提出糖皮質激素可以減輕炎癥，從而改善TBM患者預后。有研究[4-5]表明，糖皮質激素能降低TBM患者的短期死亡率，但其他研究指出糖皮質激素對TBM患者的遠期生存率和致殘率沒有影響[6]。目前應用糖皮質激素治療TBM仍有爭議，其確切機制也未完全證實。因此，本研究通過建立大鼠TBM模型，擬研究糖皮質激素對TBM的治療作用，探討其可能分子機制，為臨床應用糖皮質激素治療TBM提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要材料 血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(Santa Cruze)， 血管內皮生長因子受體1(VEGFR1)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)(Abcam)，7H9、7H11培養基(Difco)，ELISA試劑盒(Cusabio Biotech，Newark)，地塞米松磷酸鈉注射液(上海現代哈森藥業有限公司)，注射用甲強龍(Pfizer Manufacturing Belgium NV)，結核分枝桿菌H37Rv(北京市結核病胸部腫瘤研究所)。

1.2實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠20只，體質量250～300 g，購自貴州醫科大學動物中心。大鼠飼養于通風、清潔、日夜節律的環境中，自由覓食。將實驗大鼠隨機分為4組，分別為對照(Control)組、結核性腦膜炎(TBM)組、TBM+地塞米松(DXMS)組和TBM+甲基強的松龍(MSS)組，每組5只。本研究獲得了貴州醫科大學附屬醫院動物倫理委員會的批準。

1.3方法

1.3.1TBM大鼠模型的建立 參照文獻，TBM組、TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠均先建立TBM模型。取在7H9培養基上生長2周的結核分枝桿菌H37Rv，經過濾、離心、分散，制成濃度為2.5×106CFU/mL菌懸液，經大鼠尾靜脈注射0.2 mL/只(菌量5×105CFU/只)，置于濕度(55±15)%，(21±2)℃負壓環境中，保持12 h燈光/12 h黑暗的循環，動物可以方便地獲取食物和水，14 d后形成結核性腦膜炎模型[7]。Control組大鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL。

1.3.2糖皮質激素治療 TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠在TBM模型建立后分別腹腔注射DXMS 0.4 mg/kg·d及MSS 4 mg/kg·d，TBM組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，持續一周。在用藥后第7天分別斷頭處死進行實驗指標觀察，并與TBM組同期大鼠進行比較。

1.3.3腦組織含水量測定 處死動物后，盡快取出腦組織，觀察腦大體標本。濾紙吸凈表面血漬后，取左側大腦半球按Elliott公式計算含水量：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4HE染色及VEGF、VEGFR1、VEGFR2免疫組織化學染色 大鼠心臟灌注取腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋。取右側大腦半球中1/3份全層腦組織制片。HE染色后，光鏡觀察腦組織病理變化。進行免疫組織化學染色，切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，98℃加熱30 min進行抗原修復；3%雙氧水室溫封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，5 min/次；滴加馬血清封閉液，室溫20 min，去除多余液體；加入一抗，4℃過夜后，在37℃復溫45 min；PBS再洗3次，5 min/次；滴加生物素化二抗，37℃ 30 min；PBS洗3次，5 min/次；再加入三抗，37℃ 30 min；最后PBS清洗4次，5 min/次；DAB顯色，蘇木素復染；脫水、透明、封片、鏡檢；染色結果閱片由專人單盲進行，計數每40×高倍視野陽性細胞數。

1.3.5腦組織中炎癥因子的檢測 取右側腦組織樣研磨、勻漿后取上清液，按照說明通過ELISA試劑盒測定上清液中炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)的含量。

2 結 果

2.1腦組織病理形態改變 糖皮質激素治療1周后，肉眼觀察TBM組、TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠腦組織均有不同程度的腫脹，表現為腦溝變淺，腦回增寬，腦膜緊張，腦膜血管擴張充血，腦室和腦池等處有較多滲出物。如圖1所示，HE染色100×鏡下可見Control組腦組織細胞排列整齊，形態規則；TBM組可見腦膜增厚，腦內細胞排列紊亂，蛛網膜下腔擴張，充血明顯并伴有炎癥細胞浸潤；與TBM組比較，TBM+DXMS組和TBM+MSS組充血減輕、炎癥細胞浸潤減少，其中TBM+MSS組炎癥細胞浸潤減輕更明顯。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色

2.2腦組織含水量 TBM組腦組織含水量為(93.0±4.8)%，明顯高于Control組(70.6±2.0)%(P<0.05)。TBM+DXMS組和TBM+MSS組腦組織含水量分別為(80.1±2.8)%和(76.7±3.1)%，低于TBM組(P<0.05)，其中TBM+MSS組降低更為明顯(P<0.05)。

2.3VEGF免疫組織化學 TBM組大鼠VEGF和VEGFR2表達較正常對照組增加(P<0.05)，而VEGFR1未見明顯變化(P<0.05)。TBM+DXMS組與TBM+MSS組VEGF表達較TBM組下調(P<0.05)，VEGFR1表達上調(P<0.05)；而TBM+DXMS組與TBM+MSS組VEGFR2表達與TBM組比較，均未見明顯變化(P>0.05)；TBM+DXMS組與TBM+MSS組上述指標間未見明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織VEGF及其受體表達變化

2.4炎癥因子水平 TBM組、TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平較Control組升高(P<0.05)；而TBM+DXMS組、TBM+MSS組上述指標均低于TBM組(P<0.05)；以TBM+MSS組顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織炎癥因子檢測結果

3 討 論

糖皮質激素在臨床上已經廣泛應用于腦水腫、脊髓損傷等中樞神經系統疾病的治療，但其具體作用機制尚未完全明確。TBM時顱內常有明顯的炎癥反應，理論上糖皮質激素可以緩解炎癥，減輕腦組織水腫并降低顱內壓，從而減少腦組織的損傷。臨床上也有較多醫院經驗性使用糖皮質激素治療TBM，但療效尚不確切[4-6]。在本研究中，我們發現糖皮質激素降低了TBM大鼠腦組織的含水量，說明糖皮質激素能夠減輕TBM后繼發的腦水腫。腦水腫是TBM后重要的病理改變，其病理生理機制可以是血腦屏障的破壞，或是細胞膜上離子通道的異常。而VEGF具有很強的促進病理性血管新生、增加血管通透性的作用，已被證實與部分疾病時腦水腫的形成密切相關[7-9]。但中樞系統感染時，比如TBM患者的腦水腫發生是否也與該因子有關，目前尚不明確。本研究發現，TBM后大鼠腦組織中VEGF含量增高，說明VEGF也參與了TBM后腦水腫的發生。VEGF有2種高親和力的受體，VEGFR1和VEGFR2，兩者共同調控VEGF的病理生理作用。VEGFR1和VEGFR2存在于血管內皮細胞中，正常情況下表達水平很低，但在缺血、缺氧等情況下，血管內皮中的VEGFR表達增高[8]。我們的研究也表明，VEGFR2在TBM后表達增高。但另一受體VEGFR1的表達未見明顯變化，這與T.D.Crafts等[8]觀察到的VEGFR變化不一致。我們推測，這可能與TBM的腦水腫形成機制與其他疾病不同有關。本研究發現，應用激素后，VEGF表達水平較TBM時下降，VEGFR1表達水平升高，而VEGFR2無明顯變化，推測原因可能是VEGFR2主要表達于血管內皮，VEGF可以通過旁分泌的方式作用于血管內皮細胞，并通過與VEGFR2結合，激活PI3K/AKT信號傳導途徑，進而發揮生物學作用。而糖皮質激素的應用，則可能通過增加VEGFR1的表達，競爭性抑制VEGF與VEGFR2的結合，從而對VEGF的上述信號傳導產生負性調節作用。

炎癥反應是TBM的主要特征之一，TBM的病理生理過程也與多種炎癥因子密切相關，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等[10-11]。炎癥因子的水平不僅可以用于TBM的輔助診斷，還可以用來判斷患者的治療效果和臨床預后。本研究也檢測了IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α在TBM后的表達變化，發現TBM后上述細胞因子明顯增加，而應用糖皮質激素后這些細胞因子明顯降低，提示糖皮質激素能夠降低TBM后腦組織中的炎癥因子表達，減輕TBM后的炎癥反應。臨床經驗使用糖皮質激素治療TBM時，具體用藥選擇目前尚不統一[12-13]。本研究選用了地塞米松和甲強龍兩種類型的糖皮質激素進行比較，從結果可以看到，在降低腦組織炎癥及腦水腫方面，甲強龍效果優于地塞米松，但二者在VEGF及受體表達方面未見明顯差異。

綜上所述，糖皮質激素能夠減輕TBM大鼠腦水腫的發生，我們推測這是通過對VEGF及其受體的差異調控降低了血腦屏障通透性；糖皮質激素還能減輕TBM大鼠腦內炎癥的程度和炎癥因子的表達；相較于地塞米松，TBM大鼠使用甲強龍后腦水腫及炎癥因子表達水平下降更為明顯。目前，糖皮質激素在TBM的治療中仍有爭議，動物模型的研究為糖皮質激素在TBM治療中的應用提供了理論依據。但該工作目前尚不完善，今后的研究可以進一步完善VEGF配體的檢測，結合現有糖皮質激素對VEGF及其受體的實驗結果，更好地解釋糖皮質激素在TBM時腦水腫的作用機制，并將糖皮質激素使用中可能的副作用納入研究。