非小細胞肺癌中Cx43蛋白表達水平及其臨床意義

史 冊 張偉華 劉艷梅

肺癌屬于臨床常見惡性腫瘤，據統計，肺癌中80%以上屬于非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，早期 NSCLC患者術后5年總生存率可達86%，然而肺癌早期診斷較為困難，大部分NSCLC確診時已到晚期階段，5年生存率甚至在10%以下[1]。縫隙連接是細胞間信息交換重要通道，縫隙連接細胞間通訊在組織生長、組織器官內細胞間協調穩定維持等諸多方面均具有重要作用[2]。縫隙連接蛋白(connexin,Cx)是由連接蛋白基因編碼的一組蛋白質，作為縫隙連接基礎結構參與細胞生長到死亡全部過程，包括生長、發育、增殖、分化、代謝和內環境穩定維持等[3]。Cx43屬于間隙連接蛋白家族主要成員，主要在心肌組織、成纖維細胞、上皮細胞等中表達，可作為縫隙連接結構與功能基礎[4]。細胞縫隙連接蛋白的表達水平則提示細胞間通迅功能強弱，如細胞縫隙連接蛋白少則提示該細胞功能較獨立或缺乏信息交通，所以Cx表達異常所致的細胞縫隙連接功能缺陷可能和多種腫瘤惡性增殖與轉化相關[5]。基于此，本研究分析NSCLC患者癌組織Cx43表達水平，分析其表達與疾病臨床病理、轉移及預后的關系，旨在為臨床的早期診斷、治療及預后判斷提供分子學依據，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2013年12月至2017年12月收治的NSCLC行手術治療的患者76例，其中男性42例，女性34例；年齡41～79歲，平均(65.81±6.47)歲；吸煙史：有29例，無47例；病理類型：鱗癌57例，腺癌19例；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期30例，Ⅲ期27例；淋巴結轉移：無42例，有34例。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①臨床組織學或細胞學確診為NSCLC；②可接受隨訪；③經醫院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。排除標準：①合并其他部位或腫瘤類型；②合并骨髓、血液、免疫疾病；③合并心腦血管疾病；④合并嚴重感染；⑤近3個月內接受過放化療或外科手術。

1.3 檢測方法

標本4 μm厚連續切片，60 ℃條件烘烤20 min，二甲苯脫蠟后梯度酒精連續脫水，PBS清洗(3次)，去離子水沖洗，室溫下，3%H2O2阻斷10 min，PBS清洗(3次)，抗原熱修復，PBS清洗(3次)。浸于10%的BSA中，室溫下孵育5 min，非特異性位點封閉，加一抗，4 ℃孵育，PBS清洗(3次)。滴加HRP標記SP，43 ℃孵育30 min，PBS清洗(3次)，DAB顯色 10 min，PBS清洗，蘇木精溶液復染，鹽酸酒精分化，脫水10 min，封片觀察。

1.4 染色結果判斷

由兩位病理科醫師通過光學顯微鏡分析切片各位點，確定蛋白表達，閱片者均在對研究對象一般資料不了解的前提下獨立閱片和分析，對于判定結果意見存在分歧的切片，協商討論達成一致。高倍鏡下選取5個視野，保證每一視野中可觀察到的細胞數在200個以上，Cx43陽性表達定位于細胞質和細胞膜，依陽性細胞染色強度與比例判定Cx43蛋白表達結果[6]：著色程度：無(0分)，淡黃(1分)，棕黃(2分)，棕褐(3分)；陽性細胞比例：陰性(0分)，1%～25%(1分)，>25%～50%(2分)，>50%～75%(3分)，>75%～100%(4分)；染色分級為著色程度與陽性細胞比例乘積，<6分為低表達，≥6分代表高表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS20.0，計數資料以例數與率(%)表示，組間采用χ2檢驗比較；采用Logistic回歸分析影響Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達水平的因素，通過Kaplain-Maier方法描繪生存曲線，計算Cx43蛋白高表達與低表達患者生存率，并用Log-rank檢驗，P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達

NSCLC癌組織中Cx43蛋白高表達率為35.53%(27/75)，低于癌旁組織的76.32%(58/76)(χ2=25.649，P<0.05)。

2.2 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達與臨床病理特征參數的關系

性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型與NSCLC患者癌組織中Cx43蛋白表達水平無關(P>0.05)；低分化、臨床分期Ⅲ期、發生淋巴結轉移患者Cx43蛋白高表達率均低于中高分化、臨床分期Ⅰ期或Ⅱ期、未發生淋巴結轉移患者(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達與臨床病理特征參數的關系/例

2.3 影響NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達的Logistic回歸分析

將上述因素差異有統計學意義項納入多因素Logistic回歸模型，以Cx43蛋白表達作為因變量，Cx43蛋白(高表達=0，低表達=1)，以上述差異有統計學意義項作為自變量，并進行賦值，分化程度(高分化=0，中分化=1，低分化=2)、臨床分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)、淋巴結轉移(未發生=0，發生=1)，Logisitic回歸分析顯示分化程度低、臨床分期高、發生淋巴結轉移是導致Cx43蛋白低表達的獨立危險因素。見表2。

表2 影響NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達的Logistic回歸分析

2.4 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達與生存時間的關系

隨訪3年，根據患者隨訪情況，繪制3年無進展生存曲線和總生存曲線，如圖1、圖2。Cx43蛋白高表達者3年無進展生存率與總生存率分別為：66.67%(18/27)、77.78%(21/27)，高于Cx43蛋白低表達者的42.86%(21/49)、51.02%(25/49)(P<0.05)。

圖1 3年無進展生存分析

圖2 3年總生存分析

3 討論

肺癌大多數起源于支氣管黏膜或腺體，因此又被稱為原發性支氣管肺癌，是全球發病率與死亡率相對較高的癌癥類型。肺癌病因較多，包括吸煙、職業暴露、空氣污染、飲食不良以及遺傳易感性等。近年來，NSCLC發病率增加，且以老年人群為主，NSCLC癌細胞生長分裂速度較為緩慢，擴散轉移一般較晚，因為早期患者癥狀一般不明顯[7]。

相鄰細胞間信息與能量物質交換對于細胞新陳代謝、增殖、分化等生理過程均十分重要，該過程主要通過細胞間間隙連接通訊實現[8]。間隙連接通訊結構與功能異常參與多種疾病尤其是腫瘤的發生與發展。間隙連接普遍存在于動物組織中，位于細胞相鄰面，是相鄰細胞溝通的跨膜通道。目前哺乳動物連接蛋白家族包括 21種跨膜蛋白，依據家族基因編碼蛋白質分子量命名，如Cx26、Cx32、Cx43等[9]。近年來研究表明[10]Cx在大多數腫瘤細胞中表現為降低甚至缺失，而其周圍毗鄰正常細胞縫隙連接蛋白功能正常，Cx表達上調或縫隙連接蛋白功能改善可抑制腫瘤發生或逆轉其表型。Cx43屬于抑癌基因，和惡性腫瘤的發生關系密切，惡性腫瘤Cx基因抑制，常處于失活狀態，隨Cx43表達下降和缺失，可導致連接通信功能減退，細胞間信號傳遞、增殖分化受到影響，導致人體內環境紊亂，腫瘤細胞惡性演變[11]。

Liu G等[12]研究發現，基因轉染技術誘導Cx 基因表達后可明顯抑制轉化細胞生長及腫瘤形成。相關研究表明，Cx43異常表達與腎臟腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮平滑肌肉瘤、前列腺癌等的發生發展有關。本研究中NSCLC患者癌組織Cx43高表達率低于癌旁組織，表明Cx43蛋白表達率降低也是NSCLC發生的原因之一。在腫瘤細胞中，Cx43 表達的降低或缺失使細胞間通訊出現異常，機體對細胞的監視與調控力減弱，細胞過度克隆生長，Cx43表達升高促進間隙連接蛋白組裝，增加細胞間信號交流，控制細胞之間的生長[13]。郭愛萍等[14]研究利用免疫組織化學法發現，Cx43染色強度及陽性率隨肺癌分化程度下降而呈現出降低趨勢。本研究進一步分析Cx43蛋白表達水平與NSCLC臨床病理特征的關系，結果顯示Cx43蛋白表達水平與鱗癌和腺癌病理類型以及腫瘤大小無相關性，但與癌組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移均有一定的關系，Cx43蛋白表達隨著分化程度降低、臨床分期增高、淋巴結轉移，Cx43在NSCLC癌組織中的表達呈降低趨勢，提示Cx43蛋白可能參與NSCLC的進展。Cx43通過細胞間連接的穩定性維持，參與到細胞增殖調控、凋亡及細胞間信號和刺激傳遞等，使腫瘤細胞重新恢復細胞連接通訊，達到抑制腫瘤發展的目的[15]。本研究對76例NSCLC患者3年生存率進行分析，應用Kaplan-Meier法分析Cx43蛋白表達水平與NSCLC預后之間的相關性，結果顯示NSCLC癌組織中Cx43蛋白低表達的患者，其3年總生存率與無進展生存率均低于Cx43蛋白高表達者，說明Cx43蛋白表達水平與NSCLC患者生存時間有關，Cx43蛋白表達水平可被用作判斷 NSCLC患者預后的指標。

綜上所述，Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達下調，與NSCLC的發生及組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移相關，Cx43蛋白表達是NSCLC 患者總生存期的預后生物分子標志物，Cx43蛋白低表達可預示患者不良預后。