NKD2基因甲基化與口腔鱗癌臨床特征和預后的相關性

趙 聰 吳於芝 何 敏 劉 燕 楊 森

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率逐年上升，轉移和放化療耐受性是導致患者死亡的最主要原因[1-2]。口腔鱗癌的發生與發展作用機制復雜，已知眾多分子參與調控這一錯綜復雜的過程，而針對單一基因設計的靶點藥物對腫瘤遏制效果并不理想[3]。NKD2(Naked cuticle homolog 2)屬于人源NKD基因家族，位于染色體5p15.3，N端區域包含大部分的功能區域，其C端呈高度紊亂的狀態。NKD2可以負向調控經典Wnt信號通路的傳導，也骨肉瘤的腫瘤抑制因子[4-5]。DNA甲基化屬于表觀遺傳學特征之一，也是是腫瘤發生發展過程中比較常見的特征因子[6-7]，DNA甲基化在口腔鱗癌細胞中比較常見，也與口腔鱗癌的發生發展有關，主要表現為全基因組低甲基化和局部CpG島異常高甲基化[8-9]。本文具體探討了口腔鱗癌NKD2基因甲基化與臨床特征和預后的相關性，希望尋找與口腔鱗癌發生的有關基因，并研究它們的調控機制。現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用回顧性研究方法，研究得到了醫院倫理委員會的批準。2015年1月到2018年2月選擇本院診治的口腔鱗癌患者178例，納入標準：臨床與病理學資料完整；符合口腔鱗癌的病理學診斷標準；臨床與病理學資料完整；年齡20～70歲。排除標準：妊娠與哺乳期患者；精神系統疾病患者；臨床與病理資料不完整者；嚴重心、腎功能不全患者。

1.2 NKD2基因甲基化檢測

采集所有患者的空腹外周靜脈血3～5 ml，3000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)，分離上層血清。使用血液基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取血液標本中的DNA，采用PCR擴增目的基因進行基因型分析。本研究所涉及的NKD2基因的甲基化檢測引物序列均由上海生工公司合成。根據亞硫酸氫鹽原理設計未甲基化(unmethylation，U)、甲基化(methylation，M)的特異性引物，NNKD2-M=(ENKD2-M)△CT NKD2-M(對照-試驗)÷(EALU)△CT ALU(對照-試驗)。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，(94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環40次)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

NNKD2-M=(ENKD2-M)△CT NKD2-M(對照-試驗)÷(EALU)△CT ALU(對照-試驗)，>0.199為高甲基化，反之為低甲基化。

1.3 臨床資料調查

調查所有患者的年齡、性別、腫瘤直徑、病理分級、體重指數、吸煙史、糖尿病史等資料。同時隨訪到2019年2月，記錄所有患者的生存情況。

1.4 統計學方法

應用SPSS19.00軟件進行分析，計量數據、計數數據采用均數±標準差、百分比表示，計量數據、計數數據對比采用t檢驗與χ2檢驗，多因素分析采用Logistic回歸分析，相關性分析采用直線相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NKD2基因甲基化情況

在178例患者中，NKD2基因高甲基化78例，占43.8%；低甲基化100例，占56.2%。兩組的腫瘤直徑等指標對比差異無統計學意義(P>0.05)，高甲基化組的吸煙史、糖尿病史、Ⅲ級+Ⅳ級病理分級等比例顯著高于低甲基化組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料對比

2.2 預后情況對比

隨訪到2019年7月，高甲基化組的平均生存時間為(20.32±2.18)個月，顯著短于低甲基化組的(27.48±1.78)個月(t=9.742,P=0.000)。

2.3 相關性分析

在178例患者中，直線相關分析NKD2基因高甲基化與腫瘤病理分級、生存時間、吸煙史、糖尿病史顯著相關性(P<0.05)。見表2。

表2 NKD2基因甲基化與口腔鱗癌臨床特征和預后的相關性

以患者的生存時間作為因變量，以NKD2基因高甲基化、吸煙史、糖尿病史、病理分級作為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示：NKD2基因高甲基化、吸煙史、糖尿病史、病理分級為影響患者預后的主要因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響口腔鱗癌患者生存時間的因素分析

3 討論

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升的趨勢。口腔鱗癌患者五年生存率只有50%，轉移和放化療耐受性是口腔鱗癌致死的主要原因[10]。因此，闡明口腔鱗癌細胞轉移和放化療耐受的分子調控機制將為開發臨床診斷的分子標志物、確定臨床治療的藥物靶點以及制定有效的臨床治療方案提供理論和實驗依據[11]。

口腔鱗癌的發生發展是多因素、多階段，多種癌基因相互作用的復雜過程，但是具體的機制還不明確。甲基化是表觀遺傳學的重要表現方式，大量存在于高等真核生物體內[12-13]。甲基化狀態與抑癌基因的表達存在相關性，甲基化異常可以作為腫瘤發生、發展過程中的重要因素[14]。NKD2是NKD家族成員之一，可通過抑制Wnt/β-catenin通路發揮其功能[15]。NKD2可以負向調節Wnt/β-catenin 信號通路來抑制肝細胞癌的發展，其異常表達可以抑制細胞增殖、克隆形成、細胞侵襲和遷移[16]。本研究顯示：在178例患者中，NKD2基因高甲基化78例，占比43.8%；低甲基化100例，占比56.2%；高甲基化組的吸煙史、糖尿病史、Ⅲ級+Ⅳ級病理分級等比例顯著高于低甲基化組(P<0.05)，表明伴隨有NKD2基因高甲基化的口腔鱗癌患者的病情呈現惡化趨勢，也有不良生活習慣與糖尿病史。當前也有研究顯示同類不同個體的癌組織內NKD2基因表達差異較大，特別是NKD2甲基化狀況與乳腺癌的多種病理性行為相關[17-18]。

多種癌基因的異常激活以及抑癌基因的失活或缺失對口腔鱗癌的形成具有重要作用，特別是基因甲基化、基因突變可對相關基因及蛋白的功能狀態產生影響，進而影響口腔鱗癌細胞的功能狀態[19-20]。本研究顯示高甲基化組的平均生存時間顯著低于低甲基化組(P<0.05)；直線相關分析NKD2基因高甲基化與患者的病理分級、生存時間、吸煙史、糖尿病史顯著相關(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析顯示NKD2基因高甲基化、吸煙史、糖尿病史、病理分級為影響患者預后的主要因素(P<0.05)。當前也有研究顯示啟動子區域高甲基化可沉默NKD2基因可促進胃癌侵襲和轉移，也可穩定胞內游離β-catenin，促使結腸癌細胞的增殖[21-22]。當前也有研究顯示NKD2可修復抑制胃癌細胞增殖、集落形成，誘導G2/M期停滯；特別是實體瘤中NKD2啟動子甲基化可以調控促進Wnt/β-catenin的表達，從而與腫瘤發生發展關系密切[23-25]。本研究也有一定的不足，沒有明NKD2基因高甲基化的具作用位點，NKD2基因高甲基化對口腔鱗癌的調控作用還有待進一步深入分析。

總之，口腔鱗癌NKD2基因甲基化比較常見，NKD2基因高甲基化可影響患者的臨床特征與預后，有可能成為口腔鱗癌新的生物標志物。