合生元制劑對小鼠抗氧化能力和腸道菌群的影響

王涵，劉倩，郭子晨，王韻婷，王伶毓，趙江燕，張連中，孫雅煊*

（1．北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023；2.北京聯合大學應用文理學院保健食品檢驗中心，北京 100191；3.北京鴻測科技發展有限公司，北京 100176）

腸道菌群是腸道中寄生的微生物總稱，可以分為有益菌群、中間菌群和有害菌群，各個菌群相互制約，相互依賴，能夠維持腸道內的微生態平衡，對保持機體健康極其重要[1]。多項研究表明，腸道微生態紊亂與許多人類疾病有關，腸道菌群失調會導致糖尿病、心血管疾病和阿爾茨海默病等疾病[2-4]。因此，機體腸道菌群的良好共生關系與機體健康有著密切的聯系。

益生菌是對人體健康有益的活性微生物，可用來調節腸道內菌群平衡，促進腸道營養的吸收[5]。乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌可以通過積極參與宿主物質代謝的調控、免疫防御等方式建立腸道菌群的平衡，具有增強免疫力、改善血糖和血脂代謝、預防和改善酒精肝損傷等生理活性[6-9]。合生元是對宿主產生有益影響的益生菌和益生元混合物，通過促進益生菌在宿主腸道內定植增殖，同時發揮益生菌的生理活性和益生元的促生長作用，更有利于宿主健康，可以維持腸道微生物菌群平衡，改善肝硬化患者肝功能，提高免疫調節能力等[10-11]。

乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium animalissub sp.lactisV9）是一種從健康兒童糞便中分離出來的動物雙歧桿菌乳酸亞種，具有良好耐酸、耐膽鹽特性[12-14]。V9菌株可以通過調節腸道菌群，刺激抗體和細胞因子的分泌，增強機體免疫力改善腹瀉，也可以增加腸道內雙歧桿菌和乳桿菌數量從而緩解便秘[15-16]。干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang）具有抗氧化、增強免疫、改善血脂和調節脂質代謝等功能[17-19]。此外，干酪乳桿菌Zhang還可以增加腸道中的乳桿菌屬、羅氏菌屬、糞球菌屬等有益菌和抑制布勞特氏菌屬、雷爾氏菌屬等有害菌的生長，起到調節腸道菌群作用[20-21]。植物乳桿菌 P-8（Lactobacillus plantarum P-8）是從牧民傳統發酵的奶制品中分離得到的一株益生菌，廣泛應用于發酵食品，能夠在體外抑制大腸桿菌生長，在臨床試驗中口服植物乳桿菌P-8能夠增加腸道中的雙歧桿菌，減少致病菌[22-23]。鼠李糖乳桿菌R9639分離自天然發酵酸馬奶，具有良好的耐受性，能夠以活的狀態進入人體腸道。上述幾種益生菌在調節腸道菌群方面表現出良好活性，因此研究者對這些菌株復配后的活性進行分析。白曉曄[16]利用干酪乳桿菌Zhang、乳雙歧桿菌V9混合受試于便秘患者，發現混合益生菌有助于調節炎癥因子，進而改善便秘；Xu等[24]利用干酪乳桿菌Zhang、植物乳桿菌P-8和乳雙歧桿菌V9灌胃幼犬，發現其具有改善腹瀉的功效。上述復配菌劑的活性多集中在便秘腹瀉方面，鮮有研究將4種益生菌與益生元復配后對于抗氧化性、腸道菌群調節活性進行研究。本研究按比例混合4種益生菌與低聚果糖，探究合生元制劑對小鼠腸道菌群影響及其抗氧化作用，為益生菌功能食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

48只18 g～22 g BALb/c健康SPF級雄性小鼠、基礎飼料[許可證號：SCXK（京）2019-0008]：北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗動物飼養于北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心SPF級動物室，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038。本研究動物實驗設計和實施方案已通過了北京聯合大學倫理委員會審核和批準（實驗動物倫理委員會意見書編號2021-5）。

1.1.2 實驗菌株

鼠李糖乳桿菌R9639、植物乳桿菌P-8、干酪乳桿菌Zhang、乳雙歧桿菌V9：北京鴻測科技發展有限公司。

1.1.3 實驗儀器

Infinite M NANO TECAN酶標儀：廣州深華公司；UV-4802紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；CPA225D電子分析天平：美國Sartorius公司；Centrifuge 5702 RH-低速離心機：德國Eppendorf公司；Hula Dancer basic渦旋混合儀：德國IKA公司；Milli-Q EQ 7000實驗室超純水機：法國Millipore公司。

1.1.4 試劑

伊紅美藍瓊脂、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂、乳桿菌選擇性培養基、雙歧桿菌選擇性培養基、氯化鈉：麥克林試劑公司；冰乙酸、低聚果糖：海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷胱甘肽測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒、總超氧化物歧化酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；白介素-6試劑盒、白介素-1β試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及動物分組

將乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8、干酪乳桿菌Zhang和鼠李糖乳桿菌R9639混勻（活菌數占比：V9為62.5%，Zhang為12.5%，R9639為12.5%，P8為12.5%），制備混合菌劑。48只雄性小鼠適應性喂養一周后，將其隨機分為4組，每組12只，記為對照組、L組（0.2×107CFU/kg+0.05 g/kg低聚果糖）、M 組（0.4×107CFU/kg+0.1 g/kg低聚果糖）和H組（1.2×107CFU/kg+0.3 g/kg低聚果糖），每日灌胃一次，連續灌胃14 d。每天記錄小鼠體重與攝食量。

1.2.2 臟器系數測定

灌胃14 d后，小鼠眼眶采血，脫頸處死，分別取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、胸腺和小腸并測定質量，計算臟器系數。

1.2.3 細胞因子測定

各組小鼠眼眶采血至離心管中，制備血清，嚴格按照ELISA說明書檢測白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平。

1.2.4 抗氧化指標測定

取出各組小鼠肝臟、小腸，將0.9%生理鹽水和樣品按9∶1的體積比進行勻漿，嚴格按照試劑盒說明書進行操作測定肝臟、小腸組織中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T-superoxide dismutase，T-SOD） 活性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性。

1.2.5 菌群計數

第0天給予灌胃前和第14天給予灌胃后24 h，在無菌條件下撿取適量小鼠糞便，在稀釋液中充分振蕩混勻，10倍系列稀釋至10-8。所用培養基和培養條件如表1所示。

表1 腸道菌群檢驗用培養基、培養條件Table 1 Medium and culture conditions for intestinal flora test

1.2.6 糞便中腸道菌群的16S rDNA高通量測序分析

灌胃合生元制劑14 d后，收集4組小鼠的新鮮糞便0.5 g以上，提取并檢測樣本的基因組DNA，利用引物 341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）對細菌16S rDNA的V3-V4區進行擴增。瓊脂糖膠電泳純化的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物，選擇主帶大小在400 bp～450 bp之間的序列，割膠回收目標條帶，使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒構建文庫，通過定量和文庫檢測上機測序。

1.2.7 數據處理

使用SPSS 19.0進行數據統計分析，通過單因素方差分析對照組與各劑量組之間顯著性差異。小鼠腸道菌群計數，各劑量組與空白組間采用獨立樣本t檢驗，各組自身前后比較采用成對t檢驗。

2 結果與分析

2.1 合生元制劑對小鼠體重與攝食量的影響

小鼠體重與攝食量見圖1。

圖1 合生元制劑對小鼠體重和攝食的影響Fig.1 Effect of synbiotics on body weight and food intake of mice

由圖1可知，與對照組相比，給予合生元制劑各組的小鼠的體重、攝食量差異不明顯。

2.2 合生元制劑對小鼠臟器影響

小鼠臟器系數見表2。

表2 小鼠臟器系數Table 2 Mouse organ coefficient

由表2可知，與對照組相比，各組小鼠的心、肝、脾臟、肺、腎和胸腺臟器系數無顯著差異。

2.3 合生元制劑對炎癥因子的影響

小鼠血清中IL-1β含量和血清中IL-6含量見圖2。

圖2 血清中IL-1β含量和血清中IL-6含量Fig.2 Serum IL-1β and IL-6 levels

由圖2可知，與對照組相比，H組IL-1β含量顯著下降（p＜0.05），IL-6含量有下降趨勢，但無顯著差異（p＞0.05）。IL-6參與體內各種炎癥反應介導的免疫損傷，并在病毒感染及其進展中發揮重要作用[25]。IL-1β是由單核細胞和其他細胞分泌的細胞因子，可誘導關節內細胞產生其他炎癥介質，加重炎癥反應[26]。有相關研究發現，高脂飲食導致血清IL-1β和IL-6含量顯著增加，在給予乳雙歧桿菌V9后抑制了血清中IL-1β和IL-6 的產生[12]。Zheng等[27]發現，給予 1×105CFU 的干酪乳酸菌Zhang給哺乳期小鼠可以減少小鼠乳腺組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的表達。本研究中IL-1β水平顯著降低，說明合生元制劑可能影響促炎因子的產生。

現如今國內的電力企業使用監測系統時結合自動化技術具有重要的影響作用，合理使用自動化在線檢測，可以及時找出設備運行期間的故障，并可對設備運行的安全性起到保障作用，進而實現供電系統中的數據采集工作。通常情況下，國內的自動化監測系統在監測技術研究領域一直使用到大量的人力、物力，且監測技術的開發和利用更是為實現電力系統的自動化管理，并在減少成本的同時還可以有效提升我國電力企業的經濟效益和運行效率。

2.4 合生制劑對抗氧化指標的影響

小鼠小腸及肝臟組織抗氧化指標見表3。

表3 合生元制劑對小鼠小腸及肝臟組織抗氧化指標Table 3 Antioxidant indexes of small intestine and liver tissues in mice administrated with synbiotics

由表3可知，在小腸和肝臟組織中，與對照組相比，各個劑量組T-SOD活力、GSH含量和GSH-Px活力均有明顯的升高，其中，H組有極顯著升高（p＜0.01）。小腸組織中的M、H組MDA含量顯著降低（p＜0.05），肝臟組織中的H組MDA含量顯著降低（p＜0.05），說明合生元制劑有著較好的抗氧化能力。李欣益等[28]曾探討益生菌雙歧桿菌V9對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝大鼠肝功能、氧化應激及脂代謝的影響，研究發現灌胃V9的大鼠肝臟MDA含量顯著降低，SOD活力顯著升高。

2.5 益生菌對小鼠腸道微生物的影響

2.5.1 合生元制劑對常見腸道微生物的影響

小鼠腸道微生物含量見表4。

表4 對小鼠腸道微生物含量的影響Table 4 Effect of synbiotics on mouse intestinal flora lg CFU/g

由表4可知，各組灌胃前各類微生物含量均無明顯差異。灌胃14 d后，對照組灌胃前后對比無差異。各劑量組的腸桿菌、腸球菌這兩種有害菌灌胃前后對比無顯著差異，L組的乳桿菌和雙歧桿菌這兩種有益菌灌胃前后對比顯著增加（p＜0.05），M、H組乳桿菌、雙歧桿菌胃前后對比極顯著增加（p＜0.01）。

與對照組相比，灌胃14 d后，各劑量組的腸桿菌、腸球菌均無顯著差異（p＞0.05）。各劑量組乳桿菌、雙歧桿菌都明顯增加，M、H組效果極顯著（p＜0.01）。

綜上可以說明灌胃合生元制劑可以促進有益菌的增長，有助于調節腸道菌群的平衡。

2.5.2 對腸道微生物多樣性的影響

圖3 各組小鼠腸道菌群門水平的物種相對豐度Fig.3 Effect of synbiotics on relative abundance of dominant phyla

圖4 各組小鼠腸道菌群屬水平的物種相對豐度Fig.4 Relative abundance of intestinal microflora in mice

如圖3、圖4所示，經過各組的數據分析發現：在門水平上，各組主要由Firmicutes和Bacteroidota組成，與對照組相比，各個組Actinobacteriota豐度明顯增加，L組 Verrucomicrobiota明顯增加，M、H組 Verrucomicrobiota明顯減少。在屬水平上，對照組主要包括Bacteroides、Alistipes、Akkermansia、Lachnospiraceae_NK4A136_group，L組主要包括 GCA-900066575、Bacteroides、Alistipes、Akkermansia、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lactobacillus、Bifidobacterium，M、H 組主要包括 Bacteroides、Alistipes、Lachnospiraceae_NK4-A136_group、Lactobacillus、Bifidobacterium。與對照相比各劑量組Lactobacillus、Bifidobacterium均明顯增多，Lachnospiraceae_NK4A136_group減少。

差異物種相對豐度聚類熱圖見圖5。

圖5 差異物種相對豐度聚類熱圖Fig.5 Heat map of relative abundance of differential taxa

由圖5可以看出，與對照組相比，L組Rikenella顯著增加（p＜0.05）、achnospiraceae_NK4A136_group和Lachnospiraceae_UCG-001顯著減少（p＜0.05）。M組Roseburia、Muribaculum 顯著減少（p＜0.05），Bifidobacterium 顯著增加（p＜0.05），GCA-900066575、Lachnospiraceae_UCG-001 極顯著減少（p＜0.01），Rikenella、unidentified_Ethanoligenenaceae、Alistipes、Odoribacter、Lac －tobacillus極顯著增加（p＜0.01）。H組Bacteroides顯著減少，Bifidobacterium、Helicobacter、Lactobacillus、Rikenella、Alistipes顯著增加（p＜0.05）。

M、H 組中 Alistipes、Bifidobacterium 和 Lactobacillus顯著增加（p＜0.05），Alistipes可能與肝纖維化、結腸炎、癌癥免疫治療和心血管疾病相關[29]。Sung等[30]將患有退補償性肝硬化的患者與急性肝腦病患者之間的糞便微生物群進行比較時，發現Alistipes豐度減少與肝腦病復發的增加有關。雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人類胃腸道中的優勢菌群之一，可以有效抑制腸道病原體的抑制和輪狀病毒感染[31]。乳酸菌（Lactobacillus）可以改善胃腸道功能、抑制腸道內有害菌生長、提高機體免疫力等功能[32]。

MRPP分析，主要是用于分析高維度數據組間相似性的統計方法。MRPP分析見表5。

表5 MRPP分析Table 5 Multi-response permutation procedure（MRPP）analysis

對組間群落結構差異進行MRPP分析，A＞0表示各組間差異大于組內差異，組間差異大，顯著性小于0.05說明差異顯著[33]。由表5可知，與對照組相比，各個組的組間差異均大于組內差異，其中對照組與M、H組有極顯著差異（顯著性＜0.01）。

3 結論

根據各組小鼠腸道中菌群含量變化差異及菌群結構分析結果可知，合生元制劑可以增加小鼠腸道中雙歧桿菌及乳桿菌，增加有益菌豐度，與此同時抑制炎癥因子產生，增強抗氧化能力。本次研究結果進一步探究了益生菌在腸道中的作用，為研究合生元制劑在功能食品中的開發與研究提供幫助。