不同品種紅肉柚類胡蘿卜素組分及其抗氧化能力研究

羅懌，李金強(qiáng)，李文云，王小柯，解璞

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550006）

柑橘果實(shí)品質(zhì)分為外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)，外觀品質(zhì)包括大小、形狀、色澤等。內(nèi)在品質(zhì)主要指糖酸含量、出汁率、可溶性固形物含量等。類胡蘿卜素的種類與含量不僅決定柑橘果實(shí)的外觀品質(zhì)，也影響其營養(yǎng)品質(zhì)和保健功能[1-2]。柑橘果實(shí)中含有豐富的類胡蘿卜素，因其在400 nm～500 nm內(nèi)有強(qiáng)光吸收能力，使果實(shí)呈紅色、橙色和黃色等色澤[3]。類胡蘿卜素由于含有較多的共軛雙鍵，具有抗氧化、降低癌癥發(fā)病率和抗慢性疾病等功效[4]。

柑橘類果實(shí)主要呈色色素為類胡蘿卜素和花青素[5]，其類胡蘿卜素種類約190種[6]，在果實(shí)中主要積累葉黃素，包括玉米黃素，β-隱黃質(zhì)等種類[7]。果皮是類胡蘿卜素積累的主要部位，通常果皮比果肉類胡蘿卜素含量高2.5倍～15倍[8]。研究顯示，不同種類柑橘果實(shí)成熟時類胡蘿卜素呈現(xiàn)偏好性積累，不論果皮還是果肉中類胡蘿卜素含量均是橘類最高，柑類高于雜柑類，柚類最低的規(guī)律[9-10]。類胡蘿卜素在柚果實(shí)成熟時呈現(xiàn)出不同的顏色，果肉顏色從琯溪蜜柚的白色到葡萄柚的紫紅色，顏色的差異除了與類胡蘿卜素含量的不同有關(guān)[11]，還與各種類胡蘿卜素占比不同有關(guān)，已證實(shí)番茄紅素是呈紅色的主要色素，β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素是呈黃色的主要色素[12]。在目前已知的柚種質(zhì)資源中，除了紫皮柚的果皮檢測出花青苷，大多數(shù)柚類都是依靠類胡蘿卜素呈色[13]。紅肉“琯溪蜜柚”的外果皮、海綿層及果肉因番茄紅素含量高[14]而顯紅色，“紅綿蜜柚”和“三紅蜜柚”果實(shí)中的呈色色素主要為番茄紅素與β-胡蘿卜素[15]，而黃肉“黃金蜜柚”果肉呈色成分主要為β-胡蘿卜素[16]。目前，柑橘主要類胡蘿卜素相關(guān)的研究主要集中于甜橙和寬皮柑橘等品種，對柚類果實(shí)中類胡蘿卜素的積累特征和機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

貴州地方柚資源豐富，已有研究發(fā)現(xiàn)“紅香柚”、“利王柚”和“印江紅橙”等紅肉品種，均具有果形較小、脆嫩化渣、高抗病性等優(yōu)點(diǎn)[17]，其成熟果肉呈紅色、粉紅色和橙色等顏色，海綿層呈深淺不同粉紅色，但并未明確其中的主要色素。為確定石阡紅橙、德江紅橙、紅香柚、印江紅橙、利王柚以及思南紅橙6個品種的果肉所含類胡蘿卜素主要種類和含量，本研究運(yùn)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對果肉中的類胡蘿卜素種類和含量進(jìn)行定性定量分析，探究其顯色特征，同時對總酚和總類黃酮等活性成分[18]進(jìn)行測定，結(jié)合鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）抗氧化能力、羥基自由基清除能力3種體外抗氧化能力測定方法，對果肉的活性成分及抗氧化能力進(jìn)行綜合比較分析，以期為貴州地方柚資源的果實(shí)品質(zhì)評價和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

柚果肉樣品：供試柚果肉共6份，分別為石阡紅橙、德江紅橙、紅香柚、印江紅橙、思南紅橙和利王柚。采自貴州省6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，均于成熟期采摘。

甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、甲基叔丁基醚、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxy toluene，BHT）抗氧化劑（均為色譜純）：德國Merck公司；標(biāo)準(zhǔn)品α-胡蘿卜素、花藥黃質(zhì)、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、γ-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素、β-隱黃質(zhì)、蝦青素、β-阿樸胡蘿卜素醛、六氫番茄紅素、辣椒紅素、八氫番茄紅素、ε-胡蘿卜素、橙皮苷（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、二甘醇（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；總抗氧化能力試劑盒：江蘇科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MM 400研磨儀：弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司；SHIMADZU CBM 30A超高效液相色譜：日本島津公司；6500 Quadrupole Trap質(zhì)譜儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ML204型萬分之一天平：瑞士梅特勒托利多公司；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：華威科創(chuàng)（武漢）科技有限公司；DW-HL538超低溫冰箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；KQ5200DE超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 果肉樣品處理方法

在柚果實(shí)成熟期進(jìn)行取樣，每個品種選取3棵樹，每棵樹各取3個整果，果肉分離混合后液氮冷凍，保存于-80℃超低溫冰箱。

1.3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定果肉類胡蘿卜素含量

1.3.2.1 果肉類胡蘿卜素的提取

取出超低溫保存的凍干果肉，研磨至粉末狀。配制正己烷∶丙酮∶乙醇體積比為2∶1∶1的提取液，在提取液中加入體積分?jǐn)?shù)為0.01% BHT。稱取100 mg的果肉粉末，加1 mL的提取液（含體積分?jǐn)?shù)為0.01% BHT）。渦旋30s后，室溫23℃下超聲20min。4℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上清液。重復(fù)以上步驟進(jìn)行兩次提取，合并兩次上清液，液氮吹干。用200 μL（乙腈∶甲醇=3∶1，體積比）混合液 ∶甲基叔丁基醚=85∶15（體積比）復(fù)溶樣品，渦旋30 s，使目標(biāo)物質(zhì)充分溶解，超聲2 min，4℃、12 000 r/min離心2 min。過0.22 μm濾膜，后保存于棕色進(jìn)樣瓶中，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析。果肉類胡蘿卜素提取試驗全程需避光處理。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取16種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于10 mL甲醇和甲基叔丁基醚體積比為1∶1的混合溶液中，配制成0.1 mg/mL的初始濃度，分別稀釋為不同的濃度梯度，以色譜的峰面積對進(jìn)樣濃度做線性回歸分析，分別建立16種類胡蘿卜素單體標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。16種類胡蘿卜素單體標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的線性方程如表1所示。

表1 類胡蘿卜素單體標(biāo)準(zhǔn)品線性方程Table 1 Linear equation of carotenoid pure standards

1.3.2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：YMC C30 柱（2 mm×100 mm，3 μm）；流速：0.8 mL/min；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

流動相A：乙腈和甲醇體積比3∶1（含體積分?jǐn)?shù)為0.01%BHT）；流動相B：甲基叔丁基醚（含體積分?jǐn)?shù)為0.01%BHT）；洗針液為甲醇；線性梯度洗脫程序：0 min，A ∶B=85 ∶15（體積比）；2 min，A ∶B=75 ∶25（體積比）；2.5 min，A ∶B=40 ∶60（體積比）；3 min～4 min，A ∶B=5 ∶95（體積比）；4 min，A ∶B=85 ∶15（體積比）；6 min，A∶B=85∶15（體積比）；大氣壓化學(xué)離子源溫度350℃，簾氣172 368.925 Pa；在6500 Quadrupole Trap質(zhì)譜儀中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測。

1.3.3 果肉總多酚提取與測定

1.3.3.1 一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取0.110 0 g一水合沒食子酸，用蒸餾水溶解、定容至100 mL，此溶液質(zhì)量濃度為1 000 mg/L；分別吸取此溶液 0、1、2、3、4、5 mL 于 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，所得一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為 0、10、20、30、40、50 mg/L。測定 765 nm吸光度，以765 nm下的吸光度為縱坐標(biāo)，一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=8.471 4X＋0.036 1，R2=0.994 1。

1.3.3.2 總多酚含量的測定

采用福林酚比色法測定植物樣品中總多酚含量[19]。取出超低溫保存的果肉，研磨至粉末狀，稱取0.300 0 g，用20 mL蒸餾水洗入25 mL容量瓶中，至100℃沸水浴中保溫30 min取出、冷卻、定容、過濾，濾液備用。吸取4 mL～6 mL濾液（加一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL），分別加入福林酚試劑1 mL及3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25mL，混勻，室溫（22℃）下顯色30min～60 min，測定765 nm吸光度，根據(jù)稀釋倍數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算果肉總多酚含量，公式如下。

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得多酚含量，μg；N為稀釋倍數(shù)；Vt為提取液總體積，mL；Vs為測定取液量，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 果肉總類黃酮提取與測定

參考NY/T2010—011《柑桔類水果及制品中總黃酮含量的測定》測定[20]。

1.3.5 體外抗氧化能力測定

參照總抗氧化能力試劑盒說明書方法測定FRAP、DPPH抗氧化能力和羥自由基清除能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件SPSS 21.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析及相關(guān)性分析，用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種柚成熟果肉顏色

不同品種柚成熟果肉顏色見圖1。

圖1 不同品種柚成熟果肉顏色Fig.1 Mature fruit flesh color of different pomelo varieties

不同品種柚成熟果實(shí)果肉顏色則存在一定差異，參照NY/T2435—2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南（柑橘）》[21]，觀測到思南紅橙為黃色，利王柚為橙紅色，石阡紅橙為淺粉紅色，德江紅橙為粉紅色，紅香柚和印江紅橙為紅色。6個品種果實(shí)海綿層均表現(xiàn)淡粉紅色。

2.2 不同品種柚類胡蘿卜素組分與含量差異

6份供試柚果肉類胡蘿卜素組分與含量情況見表2。

表2 不同品種柚果肉類胡蘿卜素含量Table 2 Content of carotenoids in different pomelo fresh mg/kg

由表2可知，檢測到柚成熟果肉中含有花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、γ-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素、β-阿樸胡蘿卜素醛、番茄紅素、辣椒紅素10種類胡蘿卜素。石阡紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞紫黃質(zhì)＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)＞β-胡蘿卜素；德江紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；紅香柚果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞番茄紅素＞葉黃素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；印江紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；思南紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞β-胡蘿卜素＞番茄紅素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；利王柚果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)。6個品種中含量最高的組分均是γ-胡蘿卜素，在10種類胡蘿卜素組分含量總和中占比均大于50%，是主要的呈色色素。石阡紅橙含量最少的類胡蘿卜素組分是β-胡蘿卜素，而其他5個品種含量最少的類胡蘿卜素組分是新黃質(zhì)。

2.3 不同品種柚總類胡蘿卜素、總多酚及總類黃酮含量

不同品種柚果肉總類胡蘿卜素、總多酚及總類黃酮含量結(jié)果見表3。

表3 不同品種柚類總胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮含量Table 3 Content of total carotenoids，total polyphenols and total flavonoids in different pomelo varieties

由表3可知，不同品種柚果肉總類胡蘿卜素、總多酚及總類黃酮含量不同。其中印江紅橙的總類黃酮含量最高，為482.22 mg/kg，其次為利王柚、紅香柚、德江紅橙、石阡紅橙和思南紅橙?？傤惡}卜素含量介于150.81 mg/kg～241.29 mg/kg，大小排序為思南紅橙＞印江紅橙＞石阡紅橙＞德江紅橙＞利王柚＞紅香柚?？偠喾雍看笮∨判驗榧t香柚＞德江紅橙＞印江紅橙＞利王柚＞石阡紅橙＞思南紅橙。

2.4 柚果肉抗氧化能力比較

不同品種柚果肉抗氧化能力大小參見表4。

表4 不同品種柚抗氧化能力比較Table 4 Comparison of antioxidant ability in pomelo different varieties

由表4可知，品種不同，果肉中的抗氧化能力有較明顯差異。6個品種柚果肉的FRAP抗氧化能力介于2.65 μmol Trolox/g～4.27 μmol Trolox/g，其中最強(qiáng)的是利王柚，其次分別是德江紅橙、紅香柚、思南紅橙、石阡紅橙、印江紅橙。DPPH抗氧化能力在1.91 μmolTrolox/g～3.25 μmol Trolox/g之間，大小排序為利王柚＞德江紅橙＞石阡紅橙＞紅香柚＞印江紅橙＞思南紅橙。羥基自由基清除率最高為利王柚，其次是紅香柚、德江紅橙、印江紅橙、思南紅橙、石阡紅橙，石阡紅橙自由基清除率最低。3種不同方法測定抗氧化能力結(jié)果較一致。

由于測定方法原理不同導(dǎo)致抗氧化能力結(jié)果有差異，為綜合評價各品種柚果肉的抗氧化能力，采用綜合抗氧化能力評價指數(shù)（antioxidant potency composite，APC）[22]來進(jìn)行評定。

不同品種果肉的APC指數(shù)參見表5，6個品種果肉的APC指數(shù)介于74.91%～100.00%，利王柚最高，其次是德江紅橙、紅香柚、石阡紅橙、印江紅橙和思南紅橙。

表5 綜合抗氧化能力指數(shù)評價Table 5 Evaluation of antioxidant potency composite

2.5 抗氧化能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮的相關(guān)性

抗氧化能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮的相關(guān)性分析結(jié)果見表6。

表6 柚果肉抗氧化能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮的相關(guān)性分析Table 6 Corrrelation analysis between the total antioxidant capacity and the contents of total carotenoids，total phenolic and flavonoid in pomelo

FRAP、DPPH和羥基自由基清除能力3種方法之間呈正相關(guān)，F(xiàn)RAP和DPPH在p<0.01極顯著水平正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r達(dá)0.853，F(xiàn)RAP和羥基自由基清除率在p<0.05顯著水平正相關(guān)，表明這3種抗氧化活性能力評價方法比較可靠。總類胡蘿卜素含量和總多酚含量（r=0.882，p<0.01）具有極顯著正相關(guān)性，總類黃酮含量（r=0.447，p<0.05）具有顯著正相關(guān)性?？偠喾雍俊⒖傤慄S酮含量分別和FRAP值，DPPH值和羥自由基清除率為正相關(guān)，而總類胡蘿卜素與PRAP值為負(fù)相關(guān)，這可能與果肉中所含花青素有關(guān)。

3 結(jié)論

對6個品種柚果肉中的類胡蘿卜素種類進(jìn)行定性定量分析，檢測到果肉中含有花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、γ-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素、β-阿樸胡蘿卜素醛、番茄紅素、辣椒紅素10種類胡蘿卜素。6個品種中含量最高的組分均是γ-胡蘿卜素，在10種類胡蘿卜素組分含量總和中占比均大于50%，是主要的呈色色素。石阡紅橙含量最少的類胡蘿卜素組分是β-胡蘿卜素，而其他5個品種含量最少的類胡蘿卜素組分是新黃質(zhì)。不同品種果肉中類胡蘿卜素含量和組分占比不同，導(dǎo)致其果肉顏色不同。檢測結(jié)果顯示，γ-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素含量較高的思南紅橙，其果肉呈現(xiàn)黃色；紅香柚和印江紅橙番茄紅素較高，果肉呈現(xiàn)紅色。果肉抗氧化活性成分中，總類黃酮含量在55.54 mg/kg～482.22 mg/kg之間；總類胡蘿卜素含量在150.81 mg/kg～241.29 mg/kg之間；總多酚含量在0.41 mg/g～0.77 mg/g之間。FRAP、DPPH和羥基自由基清除能力等3種體外抗氧化方法對果肉的活性成分及抗氧化能力進(jìn)行綜合比較分析，綜合抗氧化能力大小排序為利王柚＞德江紅橙＞紅香柚＞石阡紅橙＞印江紅橙＞思南紅橙。FRAP和DPPH抗氧化方法作用機(jī)制相同，因而兩者之間在p＜0.01水平相關(guān)性表現(xiàn)極顯著。除FRAP和總類胡蘿卜素呈負(fù)相關(guān)外，F(xiàn)RAP與總多酚和總類黃酮含量呈正相關(guān)性，DPPH和羥基自由基清除能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮含量呈正相關(guān)性。本研究明確了6種貴州地方紅肉柚果實(shí)的類胡蘿卜素的組分，也為其果實(shí)品質(zhì)的評價提供了科學(xué)依據(jù)，有助于地方優(yōu)良品種的開發(fā)利用。