響應(yīng)面法優(yōu)化紫大薯花青素超聲輔助提取工藝

陳俊樸，周璐彤，云穎，喻赫，李金華，王學(xué)梅，石惠宇

（海南大學(xué)動物科技學(xué)院，海南 ?？?570100）

紫大薯又名紫參薯、紫山藥、腳板薯，屬于薯蕷科，具有豐富的蛋白質(zhì)、單糖、二糖和人體必需的礦物質(zhì)元素，并且其營養(yǎng)成分因種植地區(qū)之間的差異而表現(xiàn)不同[1]。紫大薯所擁有的豐富的營養(yǎng)價值使其在一些地區(qū)被作為主食。劉影等[2]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，浙江紫山藥有著低脂肪、低熱量、高蛋白、蘊含多種礦物質(zhì)元素的特點，并且有著豐富的花青素、多糖，開發(fā)潛力巨大。

近年來，花青素的生物利用價值越來越被人們所熟知，其擁有的較強抗氧化功能在各種學(xué)術(shù)期刊上被報導(dǎo)?；ㄇ嗨卦趧游矬w內(nèi)起到抗衰老、抗炎、抗菌、保護肝臟、調(diào)節(jié)代謝等重要作用[3]。研究者通過相關(guān)研究證實了花青素的生物學(xué)功能，并將其運用到動物體內(nèi)，研究其抗氧化能力和代謝調(diào)控能力[4]。Aboonabi等[5]通過研究花青素在代謝綜合征患者中的代謝調(diào)控效果，發(fā)現(xiàn)花青素可以顯著降低心臟代謝性疾病患病風(fēng)險，且可以減少因代謝綜合征形成的血栓。

從植物中提取花青素已經(jīng)經(jīng)歷了多年的研究，提取方法有固液萃取法[6]、微波輔助提取法[7]、超聲輔助提取法[8]、微波-超聲協(xié)同輔助提取法[9]、超臨界萃取法[10]等。在花青素的提取過程中，提取量受到提取液類型、提取液酸堿度、溫度、提取時間等因素的影響[11]?；ㄇ嗨鼐哂休^強的極性，可以使用水或親水性的乙醇、甲醇等有機溶劑進行提取。劉超等[12]通過研究不同提取溶劑對提取花青素含量的影響，發(fā)現(xiàn)10%乙酸提取的花青素含量高達（150.01±0.13）μg/mL，顯著高于0.50%硫酸、1.50 mol/L鹽酸、0.80%檸檬酸、95%乙醇。由于花青素本身易于分解，在提取過程中一般會通過酸化提取液來減少花青素降解，考慮安全因素，通常選擇使用鹽酸或檸檬酸對其進行酸化，以提高花青素穩(wěn)定性和提取量。

花青素的獲取途徑大多是紫薯、黑枸杞、藍莓、桑葚等。郝文博等[13]通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取藍莓花青素工藝，得到最佳藍莓花青素提取率為6.51%。程秀瑋等[14]研究表明，超聲波輔助提取桑葚花青素，提取量經(jīng)優(yōu)化后最高可達到5.09 mg/g。徐穎等[15]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助酶法提取紫薯花青素經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后提取量達到2.00 mg/g。從紫大薯中獲取花青素的相關(guān)研究較少，并且紫大薯中所含花青素含量相對黑枸杞、藍莓等低，甘學(xué)德[16]通過研究49份不同品種甘薯資源發(fā)現(xiàn)，紫大薯花青素含量普遍較低，并且不同品種之間差異較大，27種紫大薯花青素含量跨度為18.09 mg/100 g～93.09 mg/100 g。

紫大薯花青素提取量低為試驗帶來諸多不便，使紫大薯中花青素資源開發(fā)較難。解決紫大薯中花青素提取量低的問題，是保證后續(xù)試驗?zāi)軌蝽樌_展的重要基礎(chǔ)，一種高效簡便的紫大薯花青素提取方案將極大提高紫大薯花青素的開發(fā)和利用速度。本文為提高紫大薯花青素提取量，采用響應(yīng)面法對提取條件進行優(yōu)化，以探索紫大薯花青素最佳提取條件，為更好更快開發(fā)和利用紫大薯花青素資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紫大薯：海南大學(xué)薯蕷基地；鹽酸、無水乙醇（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TopPette手動單道可調(diào)移液器（100μL～1000μL）：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司；紫外可見分光光度計（UV-5100型）：上海元析儀器有限公司；超聲清洗儀（KX-1730T型）：北京科璽世紀(jì)科技有限公司；鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A型）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水真空泵[SHZ-D（Ⅲ）型]：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；高速萬能粉碎機（FW100）：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

本試驗采用超聲輔助提取法[17]提取花青素。將新鮮紫大薯洗凈后切片置于鼓風(fēng)干燥箱中45℃烘干，烘干后用高速萬能粉碎機打碎過80目篩，于4℃保存待用?；ㄇ嗨靥崛∫翰捎脽o水乙醇∶超純水=2∶1的體積比配制，用鹽酸進行酸化處理。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

以提取液鹽酸體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比3個條件進行單因素分析。設(shè)置料液比為 1∶5、1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），提取液鹽酸體積分?jǐn)?shù) 0.25%，超聲30 min，靜置提取1.5 h，過濾取濾液，測定濾液中花青素含量，計算紫大薯花青素提取量；設(shè)置提取液鹽酸體積分?jǐn)?shù)為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、2.00%，料液比1 ∶20（g/mL），超聲 30 min，靜置提取 1.5 h，過濾取濾液，測定濾液中花青素含量，計算紫大薯花青素提取量；設(shè)置超聲時間為 10、20、30、40、50 min，提取液鹽酸體積分?jǐn)?shù) 0.75%，料液比 1∶20（g/mL），靜置提取 1.5 h，過濾取濾液，測定濾液中花青素含量，計算紫大薯花青素提取量。

1.3.3 花青素提取量計算

采用pH示差法測定花青素含量?；ㄇ嗨靥崛×坑嬎愎饺缦耓18]。

式中：A 為（A520nm-A700nm）pH1.0與（A520nm-A700nm）pH4.5差值；M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量，449.2g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；e為摩爾消光系數(shù)，26900 L/（mol·cm）；l為光程，cm；V為提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

基于單因素試驗結(jié)果進行三因素三水平響應(yīng)面試驗，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)處理

各試驗重復(fù)3次，使用SAS 9.4對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，使用origin2021b繪圖，使用Design Expert 10進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對紫大薯花青素提取量的影響

料液比對紫大薯花青素提取量的影響見圖1。

圖1 料液比對紫大薯花青素提取量的影響Fig.1 The effect of soil-liquid ratio on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖1 可知，料液比在 1 ∶5（g/mL）～1 ∶20（g/mL），花青素提取量隨溶劑量的增多而提高，在1∶20（g/mL）～1 ∶25（g/mL）出現(xiàn)小幅度下降趨勢，且在 1 ∶5（g/mL）～1 ∶15（g/mL）花青素提取量增長較快，在 1 ∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）增長、下降幅度較小。因此選擇料液比1 ∶20（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.2 鹽酸體積分?jǐn)?shù)對紫大薯花青素提取量的影響

鹽酸體積分?jǐn)?shù)對紫大薯花青素提取量的影響見圖2。

圖2 鹽酸體積分?jǐn)?shù)對紫大薯花青素提取量的影響Fig.2 The effect of hydrochloric acid content on the extraction efficiency of anthocyanin

由圖2可知，提取液中鹽酸體積分?jǐn)?shù)在0.25%～0.75%時花青素提取量上升較快，在0.75%～2.00%提取量開始下降，且在0.75%～1.00%之間下降最快，從1.00%～2.00%之間下降較為平緩。因此選擇鹽酸體積分?jǐn)?shù)0.75%進行后續(xù)試驗。

2.1.3 超聲時間對紫大薯花青素提取量的影響

超聲時間對紫大薯花青素提取量的影響見圖3。

圖3 超聲時間對紫大薯花青素提取量的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of anthocyanin

由圖3可知，超聲時間10 min～20 min提取量上升較快，超聲時間20 min～50 min提取量開始下降，且在30 min～40 min下降最快。因此選擇超聲時間20 min進行后續(xù)試驗。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

以料液比、鹽酸體積分?jǐn)?shù)、超聲時間為試驗因素，紫大薯花青素提取量Y為考察指標(biāo)，得到回歸方程為Y=89.56+6.26A-10.00B-2.85C-0.76AB+2.08AC+0.66BC-6.46A2-10.85B2-8.20C2。

回歸模型方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quad ratic model

由表3可知，該模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.973，表明試驗結(jié)果與預(yù)測值之間差異較小。該響應(yīng)面回歸模型達到極顯著水平（p<0.01），表明該二次模型能夠擬合實際結(jié)果，誤差較小。在三因素三水平的范圍內(nèi)，對花青素提取量產(chǎn)生影響的因素順序為鹽酸體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間。并且 A、B、A2、B2、C2對花青素提取量產(chǎn)生極顯著影響（p<0.01），C對花青素提取量產(chǎn)生顯著影響（p<0.05），而 AB、AC、BC 對花青素提取量的影響不顯著，說明料液比、鹽酸體積分?jǐn)?shù)、超聲時間之間的互相作用對花青素提取量影響不大。

2.2.2 響應(yīng)面和等高線圖結(jié)果

各試驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖4。

圖4 各試驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

由圖4可以看出，料液比、鹽酸體積分?jǐn)?shù)、超聲時間3個因素對花青素的提取量均具有顯著影響，但是3個因素之間交互作用程度不顯著。其響應(yīng)面圖曲面的坡度可以反映隨著因素變化導(dǎo)致提取量改變程度大小，從等高線圖則能看出其因素之間交互作用的顯著程度。

根據(jù)軟件計算結(jié)果，得到紫大薯花青素最佳提取條件為料液比1∶22.50（g/mL）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)0.63%、超聲時間18.69 min。在此條件下，預(yù)測花青素最佳提取量為93.70 mg/100 g?？紤]實際操作可行性，進行驗證時將提取條件修正為料液比1∶22（g/mL）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)0.63%、超聲時間19 min。進行3次重復(fù)試驗驗證預(yù)測結(jié)果，結(jié)果表明在該提取條件下花青素的提取量為93.62 mg/100 g，相比預(yù)測值，相對誤差為0.08%。

3 討論與結(jié)論

在本次試驗中，鹽酸體積分?jǐn)?shù)在0.63%時達到最佳，鹽酸不足或過量都會導(dǎo)致花青素提取量下降，這與葛艷琳[19]在研究桑葚花青素提取過程中所得到的結(jié)果相一致。最佳料液比為1∶22（g/mL），提取液較少時會導(dǎo)致紫大薯與提取液無法充分接觸，提取效果較差。在張卉等[20]的研究結(jié)果中，黑果腺肋花楸花青素提取過程中也出現(xiàn)提取量隨著提取液量的提高而提高，提取量達到最大值后繼續(xù)增加提取液量則會產(chǎn)生一個較低的損失量。隨著超聲時間的延長，花青素提取量達到最大值，然后繼續(xù)延長超聲時間則出現(xiàn)提取量降低的現(xiàn)象。在謝丹等[21]、劉曉娜等[22]的研究中也出現(xiàn)類似情況，這種現(xiàn)象可能是由于在較長持續(xù)時間下超聲導(dǎo)致的局部高熱破壞了花青素的結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生了降解，最后表現(xiàn)出的結(jié)果為提取量下降。

本試驗通過響應(yīng)面法對紫大薯花青素提取量進行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果表明最佳提取條件為料液比1 ∶22（g/mL）、鹽酸體積分?jǐn)?shù) 0.63%、超聲時間 19 min，在此條件下花青素提取量為93.62 mg/100 g，相比優(yōu)化前提取量有著顯著性提高。本次試驗優(yōu)化了紫大薯花青素提取量，能夠更加高效快捷進行花青素提取，為今后更好開發(fā)海南紫大薯花青素資源奠定基礎(chǔ)。