復合酶法制備楊梅汁工藝優化及品質分析

馬劍，路高勇，陳智玲，高志紅，李志強，王愈，馬艷弘*

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.豐縣市場監督管理局綜合檢驗檢測中心，江蘇 徐州 221700；4.南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095）

楊梅[Myrica rubra（Lour.）S.et Zucc.]是一種具有高經濟價值和營養價值的楊梅科楊梅屬亞熱帶常綠植物，在國內外均有種植[1]。楊梅富含酚酸和黃酮等物質，是一種對人體健康有益的水果[2]。楊梅汁液豐富、采收期短，不耐儲存，每年至少30%以上的楊梅鮮果會腐爛變質，給果農造成了很大的經濟損失。因此開展楊梅的深加工技術研究，降低資源浪費率并提高楊梅附加價值，具有深遠的意義[3]。目前市場上常見的楊梅加工產品包括糖水楊梅罐頭、果醬、果汁、果酒等[4]，其中楊梅汁因具有較高的營養價值和較好的口感、風味，在市場上備受青睞。

生物酶解法是果蔬汁制備過程中較常應用的技術手段，酶解不僅可以有效破壞植物細胞壁、更好地釋放細胞內容物，提高果蔬出汁率，還有利于果蔬汁的澄清穩定和色澤改善。楊電增等[5]、劉義慶等[6]、BIAN等[7]研究發現，在多糖、番茄紅素等生物活性物質的提取以及果蔬汁的制備方面，纖維素酶和果膠酶具有協同增效的作用。楊梅汁獨特的香氣和酸甜味，是其成為消費者優選的重要因素[8-9]。氣相色譜質譜儀用于分析揮發性化合物的分子式和分子結構[10-11]，FANG等[12]研究發現，薄荷醇、石竹烯、4-松油醇、芳樟醇氧化物、芳樟醇和乙酸等化合物，構成楊梅果實獨特的香氣，但酶解后楊梅汁營養物質是否會發生變化，此類研究相對較少。

本研究采用纖維素酶和果膠酶酶解法制備楊梅汁，考察果膠酶與纖維素酶質量比、復合酶添加量、酶解溫度和酶解時間對楊梅出汁率的影響，優化其制備工藝[13]，并研究復合酶酶解法對楊梅汁營養成分、色澤、功能成分、抗氧化活性以及揮發性成分的影響，為高品質楊梅汁的制備提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟期荸薺楊梅：南京福晶農業科技有限公司；果膠酶（≥40 U/mg）、纖維素酶（≥50 U/mg）：上海藍季生物公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三吡啶基三嗪（tripyridine triazine，TPTZ）、苯酚、濃硫酸、福林酚、硝酸鋁：南京化學股份有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MJ-PB40E253C多功能榨汁機：美的集團股份有限公司；D-8紫外可見光分光光度計：上海奧析科學儀器有限公司；WSC-S色差儀：上海儀電物理光學儀器公司；WGZ-800濁度計；上海昕瑞儀器儀表有限公司；TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；WZS手持折光儀：邢臺鉅都科技有限公司；PHS-25型pH計：上海科曉科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅汁的制備

將新鮮楊梅清洗、去核、打漿、稱重，再加入一定量的果膠酶和纖維素酶，不同溫度下酶解一定時間，在5000 r/min離心15min后取上清液，計算楊梅出汁率。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 果膠酶與纖維素酶質量比對楊梅出汁率的影響

復合酶添加量0.40%、酶解溫度50℃、酶解時間60 min條件下，考察果膠酶與纖維素酶質量比（4∶0、3 ∶1、2∶2、1 ∶3、0 ∶4）對楊梅出汁率的影響。

1.3.2.2 復合酶添加量對楊梅出汁率的影響

果膠酶與纖維素酶質量比3∶1、酶解溫度50℃、酶解時間60 min條件下，考察復合酶添加量（0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）對楊梅出汁率的影響。

1.3.2.3 酶解溫度對楊梅出汁率的影響

果膠酶與纖維素酶質量比3∶1、復合酶添加量0.40%、酶解時間60 min條件下，考察不同酶解溫度（25、35、45、55、65、75 ℃）對楊梅出汁率的影響。

1.3.2.4 酶解時間對楊梅出汁率的影響

以果膠酶和纖維素酶質量比為3∶1，復合酶添加量為 0.40%，酶解溫度 45℃，考察酶解時間（0、30、60、90、120、150、180 min）對楊梅出汁率的影響。

1.3.3 響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，因復合酶質量比對楊梅出汁率影響較小，選取復合酶添加量、酶解溫度和酶解時間為因素，通過響應面分析，優化楊梅出汁率最優工藝參數。具體因素及水平如表1所示。

表1 因素及水平編碼Table 1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design

1.4 楊梅汁理化指標測定

采用苯酚硫酸法[14]測定總糖含量；采用福林酚法[15]測定總多酚含量；采用分光光度計法[16]測定總黃酮含量；采用pH試差法[17]測定花色苷含量；采用考馬斯亮藍法[17]測定蛋白質含量；采用pH計測定pH值；采用電位滴定法[14]測定總酸含量；采用手持折光儀測定可溶性固形物含量；采用濁度儀法測定濁度；采用色差儀測定L值、a值、b值，以及在420、520、620 nm處測定楊梅汁的吸光度，根據參考文獻[18]計算色度（CD=A420+A520+A620）、色調（T=A420/A520）。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1 DPPH自由基清除率測定

根據參考文獻[13]，取楊梅汁1mL于刻度試管，加入0.1 mmol/L DPPH溶液1 mL，搖勻后避光放置30 min，取上清液，測定517 nm波長處的吸光度。DPPH自由基清除率計算公式如下。

式中：A1為試驗組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.5.2 羥基自由基清除率測定

根據參考文獻[13]，取楊梅汁1 mL于刻度試管，再加入2 mg/mL FeSO4溶液、1.5 mg/mL水楊酸溶液、1% H2O2溶液各1 mL，37℃水浴下避光反應15 min，在526nm波長處測定吸光度，·OH清除率計算公式如下。

式中：A1為試驗組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.5.3 總抗氧化能力測定

采用FANG等[15]的方法，配制0.1 mol/mL乙酸鹽緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L 氯化鐵（10∶1∶1，體積比）的鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）試劑，取 1 mL 楊梅汁并添加9 mL FRAP試劑，混合均勻后，37℃水浴10 min，在593 nm處測定吸光度，帶入標準曲線Y=0.000 7X+0.058 5（R2=0.998 7），計算 FRAP 值。

1.6 數據分析

所有試驗均重復3次，試驗結果取平均值，數據采用Origin 2019與Design Expert 8.0.6進行數據分析和圖表繪制。采用SPSS 17.0進行ANOVA單因素方差分析，并檢驗數據的差異顯著性（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 復合酶制備楊梅汁單因素試驗結果

2.1.1 果膠酶和纖維素酶質量比對楊梅出汁率的影響

果膠酶與纖維素酶質量比對楊梅出汁率的影響見圖1。

圖1 復合酶質量比對楊梅出汁率的影響Fig.1 Effect of compound enzyme mass ratio on juice yield of bayberry

有研究表明，適宜環境條件下，復合酶作用效率高于單一酶[19-21]。如圖1所示，果膠酶與纖維素酶質量比為3∶1時，楊梅出汁率最高，為84.88%，顯著高于果膠酶與纖維素酶作用下楊梅出汁率（P＜0.05），與ABOUELSEOUD等[22]、BIAN等[7]的研究結果相似。由此可知，果膠酶與纖維素酶質量比為3∶1時，為制備楊梅汁最適復合酶質量比。

2.1.2 復合酶添加量對楊梅出汁率的影響

復合酶添加量變化對楊梅出汁率的影響見圖2。

圖2 復合酶添加量對楊梅出汁率的影響Fig.2 Effect of compound enzyme additionon juice rate ofbayberry

由圖2可知，隨著復合酶添加量的升高，楊梅出汁率呈先上升后趨于平穩的趨勢。復合酶添加量為0.25%～0.40%時，酶解過程加速楊梅細胞破碎，楊梅出汁率顯著升高（P＜0.05），復合酶添加量為0.40%時，楊梅出汁率為84.91%，達到最大值，表明酶解作用完全；當復合酶添加量繼續增加，底物缺失導致楊梅出汁率無顯著變化（P＞0.05）。故復合酶添加量0.40%為制備楊梅汁的最適添加量。

2.1.3 酶解溫度對楊梅出汁率的影響

酶解溫度對楊梅出汁率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對楊梅出汁率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on juice rate of bayberry

溫度對酶活力影響較大，低溫環境下酶活力會降低；高溫環境下，酶結構會被破壞，使其失活，無法發揮作用[23]。由圖3可知，當酶解溫度為25℃～45℃時，楊梅出汁率隨著溫度變化顯著上升（P＜0.05），并達到最大值為84.81%；繼續升高酶解溫度，楊梅出汁率開始下降。當酶解溫度為75℃時，楊梅出汁率為81.62%，顯著低于25℃條件下楊梅出汁率82.27%，表明在55℃～75℃溫度環境下，復合酶易變性失活，無法提高楊梅出汁率。由此確定45℃為制備楊梅汁的最適酶解溫度。

2.1.4 酶解時間對楊梅出汁率的影響

酶解時間對楊梅出汁率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對楊梅出汁率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on juice rate of bayberry

酶解時間長短與實際工業化生產、經濟效益和生產環境密切相關。由圖4可知，在0～60 min，楊梅出汁率隨著酶解時間的延長而升高，酶解時間為60 min時，楊梅果漿已酶解完全，楊梅出汁率達到最大值，為84.90%；在60 min～150 min時，楊梅出汁率無顯著變化（P＞0.05）。由此確定60 min為制備楊梅汁最適酶解時間。

2.2 響應面法優化復合酶酶解工藝

2.2.1 響應面試驗方案及結果

在單因素試驗的基礎上，選取復合酶添加量X1、酶解溫度X2、酶解時間X3為因素，出汁率Y為響應值，進行三因素三水平的響應面優化試驗，測定結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 響應面數學模型建立與顯著性檢驗

使用Design-Expert8.0.6統計分析軟件對表2中的試驗結果進行線性二次多項式回歸擬合，建立二次多元回歸方程：Y=85.28+0.18X1+0.16X2+0.18X3+0.12X1X2+0.088X1X3+0.040X2X3-0.82X12-0.65X22-0.17X32。模型和回歸系數顯著性檢驗見表3。

表3 模型和回歸系數顯著性檢驗Table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項P=0.106 3＞0.05，不顯著；R2=0.989 0，R2Adj=0.974 8，說明該數學模型與試驗結果擬合較好，試驗值與預測值有著高度的相關性，各因素與響應值間線性關系顯著，可用于楊梅出汁率理論預測。由F值檢驗可知，各因素對楊梅出汁率的影響大小順序為復合酶添加量（X1）＞酶解時間（X3）＞酶解溫度（X2）。

2.2.3 響應面分析

復合酶添加量、酶解溫度和酶解時間的交互作用見圖5。

圖5 因素交互作用圖Fig.5 Interaction of factors and contour map

3D圖可直觀地反映各因素對楊梅出汁率影響程度，由表3和圖5可知，X1、X2、X3、X12、X22、X32對楊梅汁得率的影響極顯著（P＜0.01），X1X2對楊梅汁得率的影響顯著（P＜0.05），表明復合酶添加量與酶解溫度交互作用顯著。

通過響應面分析法獲得楊梅酶解最優工藝條件為復合酶添加量0.408%、酶解溫度46.59℃、酶解時間77.69 min，此條件下楊梅出汁率理論值為85.36%。為操作方便，將上訴條件修正為復合酶添加量0.40%、酶解溫度45℃、酶解時間60 min，此條件下進行3次平行試驗，測得楊梅出汁率為（85.27±0.12）%，與理論值非常接近，說明該模型可用于生產中楊梅出汁率的分析預測。

2.3 酶解對楊梅汁理化指標及營養與功能成分的影響

果膠酶能夠降解細胞間的果膠質，將楊梅細胞從植物組織中分離出來。纖維素酶可破壞植物細胞壁，從而提高楊梅汁得率，兩種酶共同作用有利于提高楊梅汁出汁率、提升楊梅汁的營養品質[8，19]。

2.3.1 酶解對楊梅汁pH值、總酸、可溶性固形物、濁度的影響

酶解前后楊梅汁理化指標的變化見表4。

表4 酶解前后楊梅汁理化指標的變化Table 4 Changes of physical and chemical indexes of bayberry juice before and after enzymatic hydrolysis

由表4可知，復合酶酶解后的楊梅汁總酸、可溶性固形物、濁度指標均顯著增加（P＜0.05），可能是酶解后細胞破碎使有機酸、可溶性物質增加[22]，從而使總酸、可溶性固形物分別增加16.67%、9.20%。此外，總酸的增加導致pH值降低3.88%。濁度上升149.22%，分析可能是多數酶為蛋白質，添加后會增加濁度指數。

2.3.2 酶解對楊梅汁營養指標的影響

酶解對楊梅汁營養指標的影響如表5所示。

表5 酶解對楊梅汁營養指標的影響Table 5 Effects of enzymatic hydrolysis on nutritional indexes of bayberry juice mg/mL

植物細胞溶出會導致有機酸、蛋白質和多糖等營養物質含量上升，由表5可知，總糖、總多酚、總黃酮、花色苷、蛋白質均顯著增加（P＜0.05），分別增加38.64%、58.21%、67.80%、221.29%、209.83%，分析可能是植物細胞破碎，蛋白酶的添加和部分多酚酸合成酶活性升高所致。由此可知，酶解制備所得楊梅汁可提高楊梅汁營養品質。

2.3.3 酶解對楊梅汁DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率及FRAP的影響

酶解對楊梅汁抗氧化能力的影響見表6。

表6 酶解對楊梅汁抗氧化能力的影響Table 6 Effects of enzymatic hydrolysis on antioxidant capacity of bayberry juice

酚類、黃酮類化合物是體外抗氧化能力的主要作用成分，其含量變化對抗氧化活性影響很大[23]。由表6可知，酶解汁的DPPH·清除率、FRAP值顯著增加（P＜0.05），分別增加6.30%、69.03%，與多酚等物質含量上升有關。·OH清除率無顯著變化（P＞0.05）。因此，酶解汁抗氧化能力的升高可能與多酚、黃酮等功能活性物質含量的變化有關。

2.3.4 酶解對楊梅汁色澤的影響

酶解對楊梅汁色澤的影響見表7。

表7 楊梅汁與酶解楊梅汁的色澤指標Table 7 Color measurements of bayberry juice and enzymolysis juice

復合酶處理后，酶解楊梅汁顏色明顯加深。由表7可知，L值、a值、b值顯著下降（P＜0.05），分別下降54.76%、57.91%、52.72%；CD 值、T值顯著增加（P＜0.05），分別增加191.52%、19.45%，花色苷是紫紅色的自然色素，其含量的顯著增加使酶解汁色澤指標發生顯著變化，酶解楊梅汁亮度變低紅色加深，外觀與藍莓汁、黑莓汁類似[18]，更易被消費者接受；楊梅汁溶液的顏色是其對光的選擇性吸收，CD值、T值顯著上升也是顏色加深的重要表現。

3 結論

本研究以新鮮荸薺楊梅為原料，使用復合酶處理法提高楊梅出汁率，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化酶解工藝，并分析楊梅汁在復合酶處理前后理化指標與揮發性成分的差異性，并對酶解汁總酚、總黃酮、花色苷與抗氧化能力進行相關性分析。結果表明：各變量對楊梅出汁率的影響大小順序為復合酶添加量（X1）＞酶解時間（X3）＞酶解溫度（X2）；復合酶酶解最佳工藝為復合酶添加量0.40%、酶解溫度45℃、酶解時間60 min，在此工藝條件下楊梅出汁率為85.27%；酶解楊梅汁的營養指標總糖、總酚、總黃酮、花色苷、蛋白質在復合酶處理后顯著上升（P＜0.05），分別增加了38.64%、58.21%、67.80%、221.29%、209.83%，DPPH·清除率、FRAP值分別顯著增加6.30%、69.03%（P＜0.05），·OH清除率無顯著變化，色澤指標L值、a值、b值分別顯著下降 54.76%、57.91%、52.72%（P＜0.05），CD 值、T 值上升 191.52%、19.45%（P＜0.05）。

復合酶處理制備楊梅汁，可綜合提高楊梅汁的營養指標、抗氧化能力、色澤等，是楊梅深加工的重要手段，后續試驗將對其沉淀、褐變以及感官評價方面加深研究。