富鋅小麥蛋白水解物制備技術及其理化性質研究

胡曉波，完顏紅影，閆東旭，張紫琪，倪永紀，黃繼紅，祝思遠，李一帆，楊盛茹，侯銀臣*

（1.河南牧業經濟學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046；2.河南工業大學生物工程學院，河南 鄭州 450001）

小麥是世界范圍內主要的糧食作物，小麥蛋白（wheat protein，WP）是小麥粉中最主要的副產物，蛋白質含量高達72%～85%，主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白兩種蛋白組成[1]。小麥蛋白水解物（wheat protein hydrolysate，WPH）及其肽具有抗氧化、抑菌、免疫調節和促進腸道健康等生理活性[2-5]。鋅是人機體生長發育的必不可少的微量元素之一，是超過300種酶的催化活化中心的重要組成部分，可以調控細胞信號的傳導過程，對人體的代謝、生長發育的催化具有重要作用[6-7]。許多發展中國家的兒童和孕婦存在鋅缺乏癥，高效、安全地補鋅已經成為全球急需解決的公共營養問題[8]。由于鋅離子可以和多肽、蛋白質形成穩定的配合物，因此鋅與蛋白或者肽形成的螯合物與無機鋅和有機酸鋅相比更容易被人體吸收利用[9-10]。

本文以WP為原料，經超聲協同酶解得到WPH，采用響應面試驗優化WPH螯合鋅的工藝技術參數，利用紫外光譜法和傅里葉-紅外光譜法對其結構特征進行初步分析，最后考察螯合前后的基本理化性質。缺鋅會直接影響人體健康，開發具有營養和補鋅等多重功能的鋅補充劑，具有良好的市場發展前景，同時對農副產品的高值化利用也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

谷朊粉（WP含量為83.5%）：河南瑞祥生物科技開發有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）：上海源葉生物有限公司；二甲酚橙、七水合硫酸鋅、鹽酸、六次亞甲基四胺、干酪素：天津市恒興化學試劑制造有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉：洛陽昊華化學試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）：天津市科密歐化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

TG16-WS臺式離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；FT-IR5500傅里葉變換紅外光譜儀：江蘇天瑞儀器股份有限公司；UV752N紫外分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；FSH-2A均質機：新飛電器有限公司；FA224電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；3S三頻超聲波反應器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥蛋白酶解及螯合工藝流程

谷朊粉→調漿 [料液比1∶10（g/mL）]→超聲處理（40 Hz、30 min）→酶解處理（加酶量 9 000 U/g、溫度55℃、pH8.0、時間2.5 h）→滅酶→冷卻→離心→取上清→干燥（WP）→WP+ZnSO4+蒸餾水→螯合反應→冷卻→離心→取上清→醇沉→離心→沉淀物→干燥（WPH-Zn）

1.2.2 WPH-Zn制備工藝條件優化

參考李晨等[9]、吳家勁等[7]的研究方法，分別研究鋅與蛋白質量比、螯合時間、螯合溫度3個因素對鋅螯合率的影響，在此基礎上，以鋅螯合率為指標，對鋅與蛋白質量比、螯合時間、螯合溫度進行響應面優化，利用Design-Expert設計軟件設計三因素三水平響應面分析試驗，試驗因素及水平如表1所示。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Levels and factors of response surface design

1.2.3 鋅含量的測定

采用EDTA絡合滴定法測定WPH-Zn中的鋅含量[11]。

1.2.4 WPH-Zn結構表征

1.2.4.1 紫外光譜分析

配制WPH和WPH-Zn溶液，在190 nm～800 nm波長范圍內掃描得到紫外可見光譜圖，對比螯合前后光譜特征，初步判定蛋白/肽與鋅離子是否發生了螯合反應[12]。

1.2.4.2 紅外光譜分析

取干燥后的WPH與WPH-Zn，分別與KBr混合均勻并制成透明薄片，在4 000 cm-1～500 cm-1范圍內掃描得到紅外光譜圖[13]。比對螯合前后紅外光譜圖譜，初步推斷鋅與蛋白/肽的螯合位點。

1.2.5 WPH-Zn與WPH的理化性質分析

1.2.5.1 起泡性與泡沫穩定性的測定

參考丁小強[14]的方法，略作修改。取20 mL不同pH值（2、4、6、8、10）的 WPH-Zn 與 WPH 溶液（10 mg/mL），10 000 r/min條件下剪切1 min，然后測量生成的泡沫體積記為V0，靜置10 min后記泡沫體積為V10。起泡性與泡沫穩定性計算公式如下。

1.2.5.2 乳化性與乳化穩定性的測定

參考馬敬[15]的方法，略作修改。取不同pH值（2、4、6、8、10）的 WPH-Zn 與 WPH 溶液（10 mg/mL）各 12 mL，按照體積比3∶1的比例加入4 mL大豆油，10 000 r/min均質2 min，然后在0、30 min時，取底部50 μL乳化液，加入5 mL的0.1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，振蕩使其均勻混合，在波長為500 nm下測定紫外吸光度，0 min時的吸光度記為A0，30 min 時的吸光度記為 A30，T 為 2.303，φ 為乳化液中油相的體積分數0.25，C為未形成乳化液的樣品濃度（mg/mL），N為稀釋倍數。乳化性與乳化穩定性計算公式如下。

1.2.5.3 溶解性的測定

配制不同 pH 值條件下（pH 值分別為 2、4、6、8、10）的WPH-Zn與WPH溶液（10 mg/mL），然后6 000 r/min離心15 min，測定上清液中蛋白含量，計算WPH-Zn與WPH在不同pH值條件下的溶解性[16]。計算公式如下。

式中：Wa為上清液中的蛋白質含量，g；Wb為樣品中總的蛋白質含量，g。

1.3 數據處理

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，試驗計量數據采用平均值±標準差表示，通過單因素和雙因素方差分析進行比較，差異顯著水平為0.05。

2 結果與討論

2.1 WPH-Zn制備工藝條件研究

2.1.1 響應面試驗結果

在單因素試驗基礎上，對WPH-Zn制備工藝條件進行優化，響應面試驗設計結果見表2。回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiments

續表2 響應面試驗結果Continue table 2 Results of response surface experiments

對試驗結果進行二次回歸分析，計算得到回歸方程：螯合率/%=65.30+2.80A+4.30B+4.05C+1.12AB-3.17AC-1.48BC-2.81A2-9.81B2-4.01C2。由表3可以看出該模型的P＜0.000 1，表示該模型極顯著，且失擬項=0.191 9＞0.05不顯著，說明該模型的擬合水平好，該模型可以被用于WPH-Zn制備工藝條件的優化。

2.1.2 響應面試驗的交互因素分析

響應面試驗的交互因素分析見圖1。

圖1 各因素交互作用圖Fig.1 Contour plots of response surface analysis

由圖1可知，所有響應面交互圖呈凸起狀，這說明鋅與蛋白質量比、螯合時間和螯合溫度之間的交互性都對鋅螯合率有明顯的影響。方差分析結果顯示鋅與蛋白質量比對鋅螯合率影響顯著（P＜0.05），螯合時間和螯合溫度對鋅螯合率影響極顯著（P＜0.01）。交互作用分析表明，A鋅與蛋白質量比與C螯合溫度交互作用顯著（P＜0.05），AB及BC 的交互作用不顯著（P＞0.05）。

2.1.3 模型的優化及驗證試驗

通過Design-Expert軟件對試驗進行優化，按照回歸模型預測可得到最佳螯合工藝條件為鋅與蛋白質量比1.68∶1、螯合溫度63.2℃、螯合時間62.1 min，在此條件下鋅螯合率可達到66.92%。結合實際操作，工藝參數調整為鋅與蛋白質量比1.7∶1、螯合溫度65℃、螯合時間60 min，在此條件下，經3組平行試驗得到鋅螯合率為66.88%，與預測結果無顯著性差異（P＞0.05），說明回歸模型可靠。

2.2 光譜分析

2.2.1 紫外可見光譜分析

在波長為190 nm～800 nm條件下對WPH和WPHZn配制的水溶液進行紫外掃描，結果見圖2。

圖2 WPH與WPH-Zn的紫外可見光譜吸收圖Fig.2 Ultraviolet visible spectra of WPH and WPH-Zn

由圖2可知，WPH與Zn2+螯合后，193 nm處吸收峰移至197 nm，這可能是因為Zn2+與N、O鍵配對后改變了肽鍵上羰基的π→π*躍遷；256 nm處吸收峰移至282 nm處，這可能是與Zn2+螯合后改變了N-C-O配體的π→π*躍遷所致[17-19]。

2.2.2 紅外光譜分析

WPH與WPH-Zn在波長4 000 cm-1～500 cm-1的紅外光譜見圖3。

圖3 WPH與WPH-Zn的紅外光譜吸收圖Fig.3 Infrared spectra of WPHandWPH-Zn

由圖3可知，與WPH相比WPH-Zn紅外光譜主要變化有3 350 cm-1處吸收峰紅移至3 320 cm-1處，此處吸收峰是由NH對稱伸縮振動引起，說明WPH中的氨基參與了Zn2+的配對；2 930 cm-1處吸收峰紅移至2 920 cm-1處，此處吸收峰是由CH2的非對稱性伸縮振動引起，說明CH2上的氫離子有可能被鋅離子取代；1 430 cm-1處吸收峰出現明顯增強，而此處吸收峰是由酰胺鍵的C-N伸縮振動和N-H變形振動以及CH2基團的非平面搖擺振動引起，說明上述活性基團有可能均參與了螯合反應。以上分析說明Zn2+可能與肽鏈上的NH和CH2等基團發生了配對反應[20]。

2.3 WPH與WPH-Zn理化性質分析

2.3.1 溶解性分析

溶解性結果見圖4。

圖4 不同pH值條件下WPH與WPH-Zn的溶解度Fig.4 Solubility of WPH and WPH-Zn under different pH conditions

由圖4可知，WPH和WPH-Zn在不同pH值條件下的溶解性趨勢一致。隨pH值的增大，均呈現先上升后穩定的趨勢。pH值為2時，兩者溶解性均較小，這可能與其等電點有關。pH 6～pH 10時，溶解度均接近100%。

2.3.2 起泡性與泡沫穩定性分析

起泡性與泡沫穩定性結果見圖5和圖6。

圖5 不同pH值條件下WPH與WPH-Zn的起泡性Fig.5 Foaming capacity of WPH and WPH-Zn under different pH conditions

圖6 不同pH值條件下WPH與WPH-Zn的泡沫穩定性Fig.6 Foaming stability of WPH and WPH-Zn under different pH conditions

由圖5可知，在pH4～10范圍內，WPH與WPHZn起泡性較好，pH值為2時，兩者的起泡性均較差。這主要是因為小麥蛋白經酶解后，大分子蛋白降解為小分子蛋白、肽與氨基酸，黏度及表面張力降低，因此起泡性較好，而在pH值為2時，其溶解度降低，起泡性也隨之降低。

由圖6可知，WPH與WPH-Zn的泡沫穩定性隨pH值的增大，均先降低后升高。這是由于反應體系在堿性條件下，蛋白質或者肽的構象發生了變化，大量的疏水基團暴露在表面，WPH與WPH-Zn的泡沫穩定性也隨之逐漸增大[21]。

2.3.3 乳化性與乳化穩定性分析

由乳化性和乳化穩定性可以分析蛋白在油-水兩相界面的吸附能力，乳化性越好則吸附能力越強，乳化穩定性越好，說明蛋白抗拒外界條件的應變能力越強[22]。乳化穩定性與乳化性見圖7和圖8。

圖7 不同pH值條件下WPH與WPH-Zn的乳化穩定性Fig.7 Emulsion stability of WPH and WPH-Zn under different pH conditions

圖8 不同pH值條件下WPH與WPH-Zn的乳化性Fig.8 Emulsifyingactivity of WPH and WPH-Zn under different pH conditions

由圖7和圖8可知，在pH2～10范圍內，WPH與WPH-Zn的乳化性均呈現先下降后升高的趨勢。這可能是在高pH值條件下，WPH與WPH-Zn疏水性殘基暴露和溶解度提高，致使其具有較好的乳化性。WPH與WPH-Zn的乳化穩定性隨pH值的升高也呈現先下降后上升的趨勢，在pH值為6時達到最小值，堿性條件下，兩者的乳化穩定性較好。這可能是因為堿性條件下WPH與WPH-Zn親油基團暴露較多，界面膜較穩定且黏度較大，形成致密的網絡結構后使其乳化穩定性提高[23]。

3 結論

富鋅小麥蛋白水解物的最佳螯合工藝條件為鋅與蛋白質量比1.7∶1、螯合溫度65℃、螯合時間60 min，在該螯合工藝條件下，螯合率可達66.88%。光譜分析結果表明小麥蛋白水解物與鋅螯合前后吸收峰的位置發生了一定的變化，原因是Zn2+可能與肽鏈上的NH和CH2等基團發生了配對反應。理化性質研究結果表明：WPH和WPH-Zn在不同pH值條件下的溶解性趨勢一致，隨pH值的增大，均呈現先上升后穩定的趨勢，在pH值為2時，兩者溶解性均較小，在pH6～10范圍內，溶解度均接近100%；在pH值為2時，兩者的起泡性均較差，在pH4～10范圍內，WPH與WPH-Zn起泡性較好，與酸性條件相比，WPH與WPH-Zn在堿性條件下的泡沫穩定性相對較好；在pH2～10范圍內，WPH與WPH-Zn的乳化性均呈現先下降后升高的趨勢，WPH與WPH-Zn的乳化穩定性隨pH值的升高也呈現先下降后上升的趨勢，在pH值為6時達到最小值，堿性條件下，兩者的乳化穩定性較好。研究結果表明：小麥蛋白水解物與鋅螯合效果較好，螯合前后理化性質相差不大，可以作為一種潛在的新型鋅補充劑用于補鋅的功能食品中。