枯草芽孢桿菌固態發酵蝦頭制劑對小鼠生長與腸道菌群影響研究

潘朝陽，王永臻，黃文燦，劉振，黃海燕，孫建安，毛相朝

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

蝦作為海洋牧場中的海珍品之一，營養豐富、滋味鮮美，廣受消費者歡迎[1]。2020年我國蝦產量約631萬噸，蝦加工和食用過程會產生大量的蝦頭、蝦殼等副產物，約占原料的45%～70%。這些蝦加工副產物富含甲殼素、蛋白質、磷脂和蝦青素等營養物質，蝦頭與蝦殼相比，其蛋白質、游離氨基酸、脂肪和游離脂肪酸含量較高，而灰分、甲殼素含量較低[2]，因此蝦頭是蝦加工副產物中最具營養價值的一部分，但其中甲殼素、蛋白質、鈣質和脂質等成分結合緊密并且含鹽量高，直接作為飼料動物難以充分吸收利用[3]，只有小部分被干燥后才可作為低質飼料使用，而大部分被直接丟棄。蝦副產物的直接丟棄不但造成大量的資源浪費，還會造成嚴重的環境污染隱患。因此蝦副產物的高值化利用，是充分開發蝦類資源，實現我國蝦產業綠色健康發展的重要研究方向。

固態發酵是一種將固態基質中的營養物質加以利用的發酵轉化手段，非常適合應用于對蝦副產物的高值化加工，同時枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，能產生耐干燥、耐熱、抗紫外線和有機溶劑的孢子，具有很強的環境適應能力[4]，并且列于我國農業部頒發的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中[5]，可在動物飼料中使用。枯草芽孢桿菌無致病性，且具有廣譜的對抗病原體的活性，可以分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶等多種酶類，在發酵過程中可對蝦頭中的蛋白質、脂質等成分進行高效水解，有助于其營養物質的釋放和被利用。同時，枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑使用時，還可發揮腸道定植、與其他微生物競爭排斥、特定代謝物的產生和免疫系統的刺激等功能活性[6]。

有調查顯示[7]，我國寵物行業市場規模近3 000億，消費熱點聚焦在寵物飼料與用品上。而寵物飼料不同于傳統飼料注重轉化率和料肉比，其更注重適口性、風味、營養均衡和高消化率。寵物市場的消費者在飼喂寵物時往往缺乏對寵物飼料營養均衡的正確理解，容易盲目地進行自由搭配，額外為寵物提供能量棒、肉罐頭等食物，導致寵物出現消化不良或營養過剩等問題[8]。同時市場上綠色天然、營養均衡、適口性好的寵物飼料添加劑較少，而通過益生菌固態發酵蝦頭，既可以利用蝦頭中豐富的營養，又能夠同時發揮益生菌的功效，可作為一種綠色天然的寵物飼料添加劑使用。

基于以上蝦產業發展和寵物飼料添加劑市場需求，本研究以蝦頭為主要原料，通過枯草芽孢桿菌進行固態發酵轉化，并將發酵產物進行小鼠飼喂實驗，探究其對小鼠生長性能和腸道菌群的影響來驗證枯草芽孢桿菌固態發酵蝦頭制劑產品的飼喂效果，為其在寵物飼料添加劑中的應用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌OKF-004：中國海洋大學食品學院海洋食品酶學與生化工程實驗室篩選保存，篩選自中國東海深海淤泥并能以南極磷蝦粉為唯一碳氮源生長。南美白對蝦頭和麩皮：青島盛隆偉業科技有限公司；可溶性淀粉（食品級）：上海滬試國藥集團；小鼠AIN-93M標準維持飼料（由酪蛋白、蛋氨酸、玉米淀粉、麥芽糖糊精、蔗糖、纖維素、大豆油、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、重酒石酸膽堿等組成）：濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 儀器與設備

生物安全柜（HFsafe-1200LCA2）：上海力新學儀器有限公司；高壓滅菌鍋（GI80TW）：致微（廈門）儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9075A）：上海樹立儀器儀表有限公司；生化培養箱（SPX 270）：寧波市科技園區新江南儀器有限公司；高通量測序儀（NovaSeq 6000）：illumina（中國）公司。

1.3 實驗動物

30只SPF級BALB/c小鼠，日齡4周～6周，體重（17±2）g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號SCXK（魯）20190003。

1.4 方法

1.4.1 發酵蝦頭制劑制備

將南美白對蝦頭和麩皮按質量比7∶5混合得到固體基質，加水至60%含水量。固體基質按質量分數5%接種活菌數為109CFU/mL的枯草芽孢桿菌，然后在30℃的搖瓶中發酵48 h。發酵后在基質中添加0.5%的干燥保護劑可溶性淀粉，混勻后50℃鼓風干燥6 h，得到符合國家農業部標準NY/T 2131—2012《飼料添加劑枯草芽孢桿菌》的固態枯草芽孢桿菌發酵蝦頭制劑，活菌數＞109CFU/g。

1.4.2 動物分組與處理

實驗BALB/c小鼠先用維持飼料飼養8 d以適應環境，8 d后將BALB/c小鼠隨機分為3組，每組10只，分別為正常對照組（NC）、添加未發酵蝦頭對照組（MC）和添加發酵蝦頭制劑干預組（MH）。每組實驗BALB/c小鼠分為兩籠飼養。未發酵蝦頭和發酵蝦頭制劑添加量為維持飼料質量的0.1%。鼠房溫度控制在（24±2）℃，濕度（45±5）%，每隔4 d更換一次墊料。

1.4.3 小鼠體重變化、采食量測定

實驗期間每天中午稱取每只小鼠的體重和每籠小鼠食槽內剩余的飼料量并記錄。將剩余飼料丟棄，重新添加對應實驗分組飼料50 g。

1.4.4 小鼠體脂率、胸腺和脾臟指數測定

實驗第8周脫頸椎處死小鼠后，隨機選取每組每籠4只小鼠解剖，稱取腎周脂肪、睪周脂肪、胸腺和脾臟質量，體脂率和臟器指數計算公式如下。

1.4.5 生物學信息分析

實驗期間按照分組進行飼喂，每2周收集每組小鼠糞便混樣，共收集 3 次（依次記為 W1、W2、W3）；第8周脫頸椎處死全部小鼠，按實驗分組收集腸道內容物混樣，樣品（記為W4）進行16S rDNA擴增子高通量測序，測序平臺為Illumina NovaSeq，測序策略為雙端測序PE250，測序區域為16SV4，上下游引物分別為515F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，對 Illumina NovaSeq測序得到的原始數據進行篩選和嵌合體過濾，得到可用于后續分析的有效數據。為研究各樣本的物種組成，對所有樣本的有效數據，以97%的一致性進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析、菌群多樣性（物種總數、香農指數及辛普森指數）分析及多樣本比較分析，以得到全面準確的腸道微生物群落結構組成。

1.5 數據處理與分析

實驗數據處理采用統計學軟件SPSS 25.0進行分析，采用單因素方差統計學分析（One-Way ANOVA）進行數據的統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。對微生物多樣性Alpha指數（物種總數、香農指數及辛普森指數）用物種累積箱形圖和wilcox秩和檢驗來評估各樣本中微生物群落的物種豐富度及多樣性的差異。對多樣本比較分析采用無度量多維標定法（nonmetric multi-dimensional scaling，NMDS）來評估個樣本間組內與組間差異。

2 結果與分析

2.1 不同飼喂條件對小鼠體重、采食量和體脂率的影響

實驗期間不同飼喂條件下小鼠體重、采食量和體脂率的變化分別見圖1。

圖1 各實驗組小鼠體重、采食量、體脂率的變化Fig.1 Body weight change，feed intake，body fat percentage of mice in each experimental group

由圖1A可知，各實驗組間小鼠體重無明顯差異。由圖1B可知，自14 d后未發酵蝦頭對照組（MC）和發酵蝦頭制劑干預組（MH）的小鼠采食量逐漸高于對照組（NC）小鼠，而MC與MH組并無明顯差異。馮建等[9]研究表明在南美白對蝦植物蛋白日糧中添加2%由蝦頭酶解得到的蝦肽可以明顯提高誘食性，提高南美白對蝦成活率。冷向軍等[10]研究表明蝦蛄水解蛋白漿對異育銀鯽具有顯著的誘食作用。說明蝦頭對小鼠有一定的誘食效果，其原因可能是蝦頭中的風味蛋白與核苷酸等物質促進了小鼠的采食。由圖1C可知，MH組體脂率顯著低于MC組（P＜0.05），飼喂枯草芽孢桿菌發酵的蝦頭組（MH）小鼠比飼喂蝦頭組（MC）的小鼠體脂率下降了約62.9%，而NC組與MC組、MH組均無顯著性差異（P＞0.05）。劉玉芝等[11]對高血脂、肥胖小鼠飼喂枯草芽孢桿菌JS01，研究脂質代謝與腸道菌群的影響，發現枯草芽孢桿菌有降脂功能，主要是通過影響腸道菌群尤其是乳酸菌的生長繁殖來間接促進脂肪代謝和分泌各種酶類和非酶類代謝產物來降脂。蝦頭中脂肪含量高達20%[12]，脂肪含量高不但容易腐敗，而且用于動物飼喂可能引起高血脂、瘦肉率降低等影響品質的問題。而通過對蝦頭固態發酵，不但可以通過枯草芽孢桿菌分泌的脂肪酶對蝦頭脂肪進行分解，而且還可以通過腸道定植進一步影響腸道菌群促進脂肪的代謝，從而降低蝦頭脂肪含量高的負面影響，在充分發揮蝦頭營養成分豐富優勢的前提下，同時有效控制動物的體脂率。

2.2 不同飼喂條件對小鼠胸腺和脾臟指數的影響

實驗期間不同飼喂條件下小鼠胸腺和脾臟的變化分別見圖2。

圖2 各實驗組小鼠胸腺指數、脾臟指數Fig.2 Thymus index and spleen index of mice in each experimental group

胸腺和脾臟是機體的重要淋巴器官，其功能與免疫緊密相關，測定臟器指數可以直觀反映各實驗組小鼠免疫能力的強弱[13]。由圖2可知，胸腺指數在各組之間無顯著性差異（P＞0.05）；MH組與NC組小鼠的脾臟指數具有顯著性差異（P＜0.05），飼喂發酵蝦頭制劑組（MH）小鼠的脾臟指數比空白對照組（NC）提升了35.7%，說明發酵蝦頭制劑有提高脾臟指數的作用。枯草芽孢桿菌對提升免疫能力已被廣泛證明，陳俊宏等[13]對AA雞日糧添加1010CFU/g枯草芽孢桿菌、郭瑞萍等[14]在AA肉雞日糧中額外添加1011CFU/kg的枯草芽孢桿菌，實驗對象臟器指數均顯著提高。

2.3 各實驗組小鼠腸道菌群OTUs統計及物種注釋分析

通過以上不同飼喂條件小鼠生長和免疫指標的實驗結果可知枯草芽孢桿菌發酵蝦頭制劑具有降低小鼠體脂和提高小鼠免疫力的效果。為探討這一效果的影響機理，本研究從腸道菌群變化方面進行了進一步研究。

2.3.1 微生物多樣性Alpha分析

首先對微生物多樣性Alpha指數（物種總數、香農指數及辛普森指數）進行統計分析，用于分析不同飼喂條件下每組小鼠組內的微生物群落多樣性與豐度，即不同實驗組小鼠腸道菌群的種群數量。物種總數為直觀觀測到的物種數目，反映了腸道菌群的豐富度，而香農指數和辛普森指數為同時考慮腸道菌群的豐富度與均勻度的指數，其中辛普森指數主要反映了腸道菌群的均勻度。不同時期不同實驗組小鼠腸道菌群的物種總數、香農指數和辛普森指數見圖3。

圖3 各實驗組小鼠物種總數、香農指數和辛普森指數Fig.3 Observed species，Shannon，Simpson parameter of each experimental group

圖3A直觀反映OTUs的指標物種總數，其數值越大，代表樣品中OTUs數越高即樣品中檢測到的序列越多，樣品中細菌的豐富度越高。按照時間橫向對比，W1、W3和W4各實驗組物種總數無顯著性差異（P＞0.05），MH-W2組物種總數顯著低于NC-W2組（P＜0.05），而 MC-W2 組與 MH-W2、NC-W2組均無顯著性差異（P＞0.05）。按照時間縱向對比，NC組從W1到W2，W3到W4有顯著增加；MC組只在W3到W4有顯著性增加；而MH組則一直呈現增加的趨勢。群落多樣性越豐富，物種分布越均勻，香農指數與辛普森指數越大。由圖3B可知，按照時間橫向對比，MH-W1組香農指數顯著低于 NC-W1組（P＜0.05）；W2、W3和W4各實驗組香農指數均無顯著性差異（P＞0.05）。按照時間縱向對比，NC組香農指數在實驗期間保持平穩，代表其腸道菌群的多樣性和均勻度相對穩定；MC、MH組香農指數從W1到W2持續增長，后續實驗期間無顯著性變化（P＞0.05）。由圖3C可知，MH-W1組辛普森指數顯著低于NC-W1組（P＜0.05），其余各時期各組無顯著差異（P＞0.05）。

結合生物豐度指數物種總數與多樣性香農、辛普森指數，可以發現維持飼料中添加未發酵蝦頭MC組和發酵蝦頭制劑MH組在實驗期間相對于維持飼料的對照組NC，小鼠腸道菌群總體的多樣性和豐度沒有顯著性提升，W3、W4時不同實驗組小鼠腸道菌群的多樣性和豐度也沒有顯著性差異，證明維持飼料中添加未發酵的蝦頭和發酵蝦頭制劑不會破壞小鼠腸道菌群整體的多樣性和豐度。

2.3.2 物種聚類分析

在了解各實驗組菌群的多樣性和豐度情況后，對各實驗組中不同菌群的相對豐度進行聚類注釋，進一步探究腸道菌群內不同菌群的占比。種水平上各實驗組不同時期相對豐度前10的物種柱形圖見圖4。

圖4 種水平上的物種相對豐度的柱形圖Fig.4 Histogram of relative abundance of species at different levels

由圖4可知，相對豐度前5的菌種分別為羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）、產酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens）和鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）。

羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）是國際上公認的黏附性強、改善腸道環境，拮抗有害菌定植，避免腸道疾病的益生乳酸菌[15]，也是我國2010年衛健委批準的可用于食品的菌種。木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）是革蘭陽性桿菌，弱致病性的凝固酶陰性葡糖球菌的一種，主要存在于肉的腌制過程中的一種腐敗菌[16]，還有研究表明該菌會引起奶牛乳腺炎[17]。約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）同樣為我國2010年衛健委批準的可用于食品的菌種。其功能主要為抑菌[18]、抗炎[19]、提高臟器指數[20]和改善腸道環境[21]。約氏乳桿菌亞型PM308還有改善肥胖體質、降低體脂肪及減少膽固醇的用途，同時約氏乳桿菌還廣泛存在于抗過敏益生菌當中。產酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens）作為腸道擬桿菌屬的一種，主要的功能是可化能有機營養，產生機體所需的營養和能量。有研究證明Bacteroides acidifaciens促進脂肪代謝[22]、治療糖尿病和肥胖[23]和改善人類患者的放療反應[24]。鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）是一種潛在益生菌，具有抗腸道炎癥[25]和防治遲發性敗血癥的效果[26]。

由圖4可知，除了MH-W3組的羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）豐度與MC-W3組基本相等，MH組羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）這兩種益生菌豐度均高于MC組；NC組約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）僅在W1時高于MC組，NC組羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）僅在W4高于MC組；而弱致病性的木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）僅在NC-W4組中富集；鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）在 NC-W1、W2和 W4組有明顯的富集，可能是小鼠腸道有炎癥導致該菌豐度上升[27]。

通過物種聚類分析，研究發現添加枯草芽孢桿菌發酵蝦頭MH組對腸道乳酸菌等有益微生物有明顯增殖作用，對于優化腸道菌群構成，維持腸道環境有積極的意義，這與周夢佳等[28]和趙力等[29]研究結果相似。而添加未發酵蝦頭MC組對腸道菌群的益生效果雖然不如MH組，但相較于維持飼料NC組還是有一定的益生作用，表明蝦頭豐富的營養物質有利于小鼠腸道的健康。NC-W4對照組小鼠腸道木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus） 和鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）相對豐度提高，推測可能患有輕微的腸道炎癥，進一步說明了蝦頭原料和枯草芽孢桿菌蝦頭發酵制劑在抑制腸道有害菌群方面的作用，其中枯草芽孢桿菌發酵蝦頭制劑效果更為明顯。

2.3.3 多樣本比較分析

不同時期不同實驗組NMDS分析見圖5。

圖5 各實驗組NMDS分析Fig.5 NMDS analysis of each experimental group

多樣本比較分析通過NMDS來表明各實驗組之間的菌群的差異性，體現菌群分析結果的可信性，根據樣本中包含的菌群物種信息，通過點與點間的距離體現組間和組內差異，通常Stress值小于0.2時，說明NMDS可以準確反映樣本間的差異程度。圖5展示了基于OTUs水平的NMDS分析結果，不同點表示不同時期各實驗組小鼠腸道菌群，同時期相同實驗處理組的點之間的距離遠近反映了小鼠腸道菌群樣品的重復性強弱，不同圈之間的距離反映不同時期不同處理下小鼠腸道菌群的差異大小。Stress值為0.135，說明該NMDS分析可以反映不同時期各實驗組小鼠腸道菌群的差異性，隨著實驗的進行各實驗組W1、W2、W3、W4時小鼠腸道菌群差異明顯，而同一時期下各實驗組也有所差異。該NMDS分析直觀表現了不同時期飼喂未發酵蝦頭與枯草芽孢桿菌發酵蝦頭制劑對小鼠腸道菌群的差異性。

3 結論

研究結果表明，在小鼠標準維持日糧中額外添加0.1%枯草芽孢桿菌發酵蝦頭制劑與額外添加0.1%蝦頭組的小鼠相比，可顯著降低飼喂小鼠的體脂率62.9%，與飼喂維持日糧相比可提升小鼠的脾臟指數35.7%，同時小鼠腸道中羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）等有益微生物相對豐度增加。枯草芽孢桿菌發酵蝦頭制劑具有降低體脂、提高免疫力和維持腸道益生菌群平衡的效果，具有在高端寵物飼料添加劑領域的應用潛力。本研究對提升蝦頭的使用價值，促進蝦加工副產物的高值化加工利用具有一定的借鑒意義。